Abstract

Chronic active Epstein-Barr Virus infection (CAEBV) är en allvarlig sjukdom med ovanlig EBV-aktivering som kvarstår i flera år, och dess patogenes är till stor del okänd. Efter skapandet av ett exakt och reproducerbart polymeraskedjereaktionssystem för att kvantifiera EBV-DNA bestämdes virusbelastningen i perifera blodlymfocyter (PBL) hos 54 barn: 15 med CAEBV, 16 med infektiös mononukleos (IM) och 23 friska barn. Barn med CAEBV och barn med IM hade höga virusbelastningar. Lägre belastningar påvisades hos 47 % av seropositiva friska donatorer. Det fanns två tydliga skillnader mellan barn med CAEBV och barn med IM: De förstnämnda hade större virusreplikation (103-107 kopior/PBL)2,5 × 105 PBL) än de med IM, och virusreplikationen avtog hos barn med IM medan aktiv replikation kvarstod i flera år hos personer med CAEBV. Fortsatt hög virusbelastning är ett möjligt diagnostiskt kriterium för CAEBV. EBV-belastning kan möjliggöra klassificering och prognos av EBV-infektioner.

Epstein-Barr-virus (EBV) är en orsak till infektiös mononukleos (IM) och till kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV). CAEBV är en allvarlig sjukdom med ovanlig EBV-aktivering som kan vara dödlig med multipel organsvikt, och den är förknippad med maligna lymfom utan föregående immunosuppression . De kliniska symtomen på CAEBV och de serologiska avvikelser som motsvarar aktiv EBV-replikation, t.ex. markant förhöjda anti-EA-DR-antikroppar och avsaknad av EBNA-antikroppar (Epstein-Barr nuclear antigen), kvarstår i månader till år. EBV replikeras i NK-, T- och B-celler.

När infektionen väl är etablerad finns EBV vanligen kvar i B-lymfocyter under värdens livstid utan att orsaka några kliniska symtom (betecknas som latent infektion). Därför är inte bara detektering utan även kvantifiering av EBV i drabbade vävnader viktigt för att utreda EBV-sjukdom.

För att klargöra statusen för EBV-replikation hos personer med CAEBV använde vi semikvantitativ DNA-polymeraskedjereaktion (PCR) för att utvärdera och jämföra viruslaster i perifera blodlymfocyter (PBL) i 3 grupper av barn: en med CAEBV, en med IM, och friska kontroller. Vårt detektionssystem ansågs vara exakt och tillförlitligt för kvantifiering av EBV eftersom vi amplifierade en EBV-region med en enda kopia av EBV. De flesta tidigare studier inriktade sig på BamHI-W-regionen för vilken tandemrepetitionsreiteringsfrekvensen är inkonsekvent. Vi anser att den här studien är den första och största skalade studien av virusbelastning i PBL hos barn med CAEBV.

Material och metoder

Patienter och kontroller

Vi undersökte 16 barn med IM (11 pojkar, 5 flickor; åldrar, 0-8 år), 15 med CAEBV (11 pojkar, 4 flickor; åldrar, 4-19 år), 19 immunkompetenta EBV-seropositiva friska personer (10 pojkar, 9 flickor; åldrar, 1-19 år) och 4 seronegativa friska barn (3 pojkar, 1 flicka; åldrar, 1-10 år). Alla personer med IM uppvisade typiska kliniska manifestationer (t.ex. feber, tonsillit, lymfadenopati, hepatosplenomegali, leverdysfunktion och atypisk lymfocytos). Diagnosen IM ställdes på grundval av serologiska fynd av IgM-antikroppar mot viral capsid antigen (VCA) eller serokonversion av VCA IgG och/eller EA och negativa EBNA-antikroppar . Tjugotvå blodprover togs från 16 barn med IM 8 dagar till 8 månader efter sjukdomsdebuten (det första symtomet var feber hos alla patienter). CAEBV diagnostiserades enligt Rickinsons kriterier . Barn med CAEBV hade intermittent eller ihållande feber i >16 månader, med hepatosplenomegali, lymfadenopati och/eller hudutslag. Laboratoriefynden visade förhöjda transaminasnivåer, anemi, trombocytopeni och/eller polyklonal hypergammaglobulinemi. Serologisk undersökning visade på markant förhöjda antikroppstitrar mot VCA och EA. Infektion med humant immunbristvirus och reumatiska sjukdomar kunde uteslutas. Inga försökspersoner hade genomgått transplantation eller haft behandling mot cancer.

Prover

Hepariniserade 2-mL perifera blodprover samlades in. PBL isolerades med ficoll-hypaka och lyserades med 0,15 μg/μL proteinas K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA extraherades med fenol-chloroform-etanol-fällning. Det extraherade DNA:t kvantifierades med spektrofotometer, justerades till 0,25 μg/μL DNA och användes som PCR-mallar.

PCR-känslighet

EBV DNA kom från tre källor: Raji, som innehåller 50 kopior EBV per cell ; Akata, som innehåller 20 kopior per cell; och klonade BamHI-L-fragment, som blandades med DNA från navelsträngsblodceller och användes som en positiv standard. För att bestämma PCR-systemets känslighet utsattes seriella 10-faldiga utspädningar (10°-104 kopior EBV) av det extraherade DNA:t för PCR.

PCR

En nested dubbel PCR utformades för att amplifiera den konserverade regionen som kodar för gp220 (inom BamHI-L-fragmentet) . Det yttre primerparet amplifierar ett 302 bp-fragment med hjälp av oligonukleotiderna 5′-GCGAACTGGTGGACACACATGA och 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, som motsvarar positionerna 2870-3171 i B95-8 (GenBank M10593). Det inre paret amplifierar ett 239-bp-fragment . PCR:n utfördes i en 50-μL reaktion som innehöll 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM av varje primer, 2,5 U Taq DNA-polymeras (Boehringer-Mannheim) och 4 μL prov-DNA. De amplifierade produkterna kördes på 2 % agaros och färgades med ethidiumbromid, och Southern blotting användes för att bekräfta specificiteten med BamHI-L-fragmentet som sond . Varje PCR-reaktion utfördes i tre exemplar och inkluderade den negativa kontrollen för att utesluta korskontaminering. För att bekräfta PCR:s specificitet analyserades DNA från herpes simplexvirus typ 1 och 2, varicella-zostervirus, humant cytomegalovirus och humant herpesvirus-6 och -7. Ingen specifik amplifiering noterades.

Kvantifiering av EBV-genom

Mängden EBV-DNA i PBL bestämdes med hjälp av experiment med begränsande spädning. Seriella 10-faldiga utspädningar (1-10-6μg) av genomiskt DNA som extraherats från varje DNA-prov utsattes för nested PCR enligt beskrivningen ovan, och den minimala gränsen för det positiva resultatet omvandlades till virusbelastning (kopior/2,5 × 105 celler).

Resultat

Känsligheten hos PCR-systemet bestämdes noggrant med hjälp av 10-faldiga utspädningar av de tre källorna till EBV DNA: Raji och Akata, som båda innehåller konstant antal kopior av EBV-DNA per cell, och det klonade BamHI-L-fragmentet. Raji innehåller 50 kopior av EBV-genom per cell , och 1 μg genomiskt DNA från Raji-celler motsvarar det som extraherats från 2,5 × 105 celler: alltså 1,25 × 107 kopior av EBV-DNA. DNA från Raji späddes på lämpligt sätt och DNA som innehöll 10n kopior (serieutspädningar av 10°-104 kopior av viruset) amplifierades. Den lägsta gränsen för ett positivt PCR-resultat undersöktes. Upprepade undersökningar visade att känsligheten var 100 kopior per reaktion med reproducerbarhet. Resultaten var desamma med Akata DNA och med utspädningsexperimentet med 10n kopior av BamHI-L-fragment blandat med 105μg, 102μg och inget DNA från navelsträngsblodceller.

Alla PBL från försökspersoner med IM och CAEBV var positiva för EBV-genomet. Nio (47 %) av 19 prover från EBV-seropositiva friska personer var positiva. Alla PBL från seronegativa personer var negativa.

EBV-DNA i PBL kvantifierades och jämfördes för EBV-seropositiva friska kontroller, barn med IM och barn med CAEBV (figur 1). Hos friska EBV-seropositiva barn var virusbelastningen 100-1000 kopior per 2,5 × 105 PBL. I PBL från barn med IM varierade de lägsta gränserna för positiva PCR-resultat från 10° μg (2,5 × 105 PBL) till 10∼3μg (2,5 × 102/PBL)genomiskt DNA, vilket tyder på att virusbelastningen var 100-100 000 kopior/2,5 × 105 PBL. Tre blodprover som samlades in inom en månad efter sjukdomsutbrottet innehöll högre belastning (1000-100 000 kopior/2,5 × 105 PBL). PBL som samlades in >11 månader efter insjuknandet i IM tenderade att innehålla mindre mängder virus. Vi följde virusbelastningen hos 4 IM-patienter (figur 2A). Hos alla 4 minskade virusbelastningen under det kliniska förloppet men var högre (100-10 000 kopior/2,5 × 105 PBL) än hos de seropositiva friska värdarna.

PBL från barn med CAEBV hade mer EBV-DNA än prover från barn med IM. Fyra CAEBV-patienter följdes i >16 månader (figur 2B illustrerar resultaten för två patienter). Två andra patienter hade oförändrad virusbelastning under 2-3 år (105 respektive 106 kopior/2,5 × 105 PBL). Alla dessa patienter hade ihållande höga virusbelastningar, till skillnad från fynden med IM. När vi undersökte sambandet mellan de kliniska manifestationerna och EBV-belastningen var det endast feber som korrelerade med virusbelastningen. Det fanns inget samband med hepatosplenomegali, lymfadenopati, exantem, myggallergi, leverdysfunktion, anemi, trombocytopeni eller serumantikroppstitrar mot VCA, EA-DR och EBNA.

Diskussion

PCR:n som kvantifierar EBV-DNA visade att PBL från barn med CAEBV eller IM hade hög virusbelastning, vilket tyder på aktiv EBV-replikering i lymfocyterna. Virusreplikationen ansågs mer aktiv vid CAEBV än vid IM; i IM-gruppen minskade replikationen gradvis, medan aktiv replikation kvarstod i flera år hos CAEBV-patienterna.

Vårt PCR-system amplifierar EBV-specifika sekvenser som kodar för gp220, som är en gen med en enda kopia i viruset, medan de tidigare studierna riktade in sig på den interna upprepningen som är lång och belägen i BamHI-W-regionen. Eftersom repetitionsantalet i denna region är inkonsekvent vid polyklonal EBV-proliferation anses vårt system vara mer exakt för kvantifiering av EBV, även om det är mindre känsligt för detektion. Bristen på låg känslighet övervinns genom användning av nested PCR. Känsligheten var 100 kopior per reaktion, jämfört med 10 kopior i den tidigare rapporten . Vi kvantifierade EBV-genom i PBL genom serieutspädning av extraherat DNA. Vårt system som kvantifierar EBV-DNA genom seriella utspädningar av extraherat DNA visade sig vara reproducerbart och tillförlitligt.

Den PBL som samlats in från barn med IM och med CAEBV hyste större mängder EBV-genom än PBL från friska seropositiva kontroller. Av de sistnämnda hade 47 % påvisbart EBV-DNA (100-1000/2,5 × 105 PBL). EBV i 2 försökspersoner påvisades i högre nivåer än i tidigare studier (1-50/106 PBL) . Eftersom vi studerade barn kan de kortare perioderna efter primärinfektion bidra till de högre EBV-belastningarna än vad som setts i tidigare studier av vuxna, vilket påminner oss om att positiva PCR-resultat, särskilt hos barn, inkluderar asymtomatisk latent EBV-infektion.

Barnen med IM hade stora mängder EBV. EBV-belastningen kulminerade inom en månad efter debut (1000-100 000 kopior/2,5 × 105 PBL) och minskade sedan gradvis men förblev hög flera månader (⩽8) efter debut, jämfört med nivåerna hos friska kontroller. Även när de kliniska manifestationerna försvann fortsatte relativt höga nivåer av EBV-replikation i PBL.

Patienterna med CAEBV hade ihållande stora mängder EBV, vilket tyder på att kronisk oreglerad aktiv replikation av EBV i PBL resulterar i allvarlig sjukdom med dålig prognos. De faktorer och mekanismer som leder till den överraskande aktiva virusreplikationen är fortfarande oklara. Olika heterogena brister i värdets försvarssystem av både humoral och cellulär immunitet har beskrivits och kan möjliggöra aktiv virusreplikation. Hög virusbelastning i PBL (>1300 000 EBV/105 PBL) har visats vid EBV-associerad posttransplant lymfoproliferativ sjukdom (PTLD), en komplikation efter transplantationer, även om virusbelastningen minskade inom ett år parallellt med återhämtningen från immunosuppressionen. En kvantitativ skillnad i cirkulerande EBV-belastning korrelerade med EBNA-antikroppsnivån vid PTLD men inte vid CAEBV. Därför ansågs EBV:s beteende vid PTLD vara både liknande och annorlunda än vid CAEBV. Med tanke på de kliniska manifestationerna verkar CAEBV likna X-linked lymphoproliferative (XLP) syndrom , för vilket den ansvariga genen nyligen identifierades. Till skillnad från XLP-syndromet är CAEBV dock inte en ärftlig sjukdom, och kvinnor kan drabbas. Ytterligare immunologisk analys av CAEBV är nödvändig för att klargöra predisponerande faktorer för virusaktivering.

Acyclovir, interferon-α och interleukin-2 har använts för att behandla CAEBV – med otillfredsställande resultat . Våra resultat tyder på att cytotoxiska läkemedel som inducerar immunosuppression och ökar den virala aktiveringen bör väljas med försiktighet, även om de kliniska egenskaperna liknar dem för hematologiska maligniteter. Persisterande höga EBV-belastningar i PBL är ett möjligt diagnostiskt kriterium för CAEBV och kan vara användbart för att övervaka sjukdomsaktiviteten, för att klassificera sjukdomen och för att förutsäga prognosen.

Acknowledgments

Vi tackar George Klein (Mikrobiologiskt och tumörbiologiskt centrum, Karolinska institutet, Stockholm) för att han har granskat manuskriptet och Sachi Takemoto och Ai Kitamura för skicklig teknisk assistans.