Introduktion

Antaliga framsteg inom olika forskningsområden, inklusive utvecklingsbiologi, stamcellsbiologi och vävnadsteknologi, har underlättat regenerativ medicin. Den första generationen av regenerativ medicin är stamcellstransplantationsbehandling med hjälp av vävnadsbaserade stamceller, embryonala stamceller (ES-celler) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) . Benmärgstransplantation har till exempel redan blivit en vanlig behandling av leukemi och hypoplastisk anemi. Dessutom är både ES-celler och iPS-celler på väg in i kliniska prövningar för många sjukdomar och skador, bland annat leukemi, Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom, hjärtinfarkt, diabetes, leversjukdom och flera andra tillstånd . Vävnadsregenerering betraktas som den andra generationen av regenerativ medicin, och flera produkter, bl.a. hud och brosk, finns redan på marknaden. Dessutom undersöks världens första vävnadsregenerationsterapi med iPS-celler från antingen patienten eller en anonym donator i en klinisk prövning för att bota åldersrelaterad makuladegeneration.

Nästa generation av regenerativ terapi är inriktad på hela organ som består av flera olika celltyper med en komplex tredimensionell struktur. Under detta årtionde har framsteg inom stamcellsbiologin och utvecklingsbiologin gett nya möjligheter att regenerera funktionella organ. Under embryonalutvecklingen uppstår organ från respektive organkim, som framkallas av ömsesidiga interaktioner mellan ödesbestämda epitel- och mesenkymstamceller, i enlighet med individuella organbildande fält (figur 1a) . Funktionell organregenerering uppnåddes för första gången 2007 genom att man utvecklade en ny cellmanipulationsmetod för att generera en bioteknisk organkim med organinducerande potential, epitel- och mesenkymstamceller som isolerats från en embryonal organkim (figur 1b) . Denna banbrytande studie och efterföljande studier rapporterade om fullt fungerande regenerering av flera typer av ektodermala organ, vilket gav bevis för begreppet funktionell organregenerering .

Nästa paradigmskifte kom 2008 med upptäckten av organoider, som genererades genom att inducera ett organbildande fält i ett cellaggregat som härrör från pluripotenta stamceller, t.ex. ES-celler och iPS-celler, samt vävnadsstamceller (figur 1c) . Praktiskt taget alla typer av organoider kan genereras, inklusive organoider från det centrala nervsystemet (dvs. hjärnbarken, hypofysen, synskålen och innerörat) . Även om framväxten av organoider utgör ett tekniskt genombrott som nu fungerar som ett viktigt verktyg i många grundläggande biologiska och kliniska tillämpningar, kan organoider fortfarande bara delvis reproducera de ursprungliga organens struktur och funktion. Därför kan majoriteten av de enskilda organoider som hittills genererats ersätta begränsade och/eller partiella funktioner i ett komplett organ, och betraktas därför för närvarande som miniorganer. Nyligen utvecklades med framgång organoider för spottkörtlar som visar fullt fungerande organregenerering vid ortotopisk transplantation . Eftersom principerna för utvecklingen av ektodermala organ liknar principerna för andra organ är det viktigt att få en djupare förståelse för ektodermala organs regenerering för att uppnå fullständig funktionell regenerering av andra organ (figur 1a). Dessutom visade regenerering av ett integumentärt organsystem (IOS) med hjälp av en in vivo-organoidmetod tydligt på möjligheten till organsystemregenerering .

I denna översikt beskriver vi de senaste framstegen inom organregenerering med hjälp av olika stamcellspopulationer och strategier baserade på utvecklingsbiologi och stamcellsbiologi, och vi diskuterar de framtida riktningarna för organersättningsterapi som nästa generation av regenerativ medicin för organ.

Utveckling av en tredimensionell cellmanipulationsmetod, organgroddmetoden, med hjälp av embryonala celler

Forskare har under flera decennier försökt regenerera organ genom att kombinera funktionella celler, ställningsmaterial och fysiologiskt aktiva ämnen med hjälp av vävnadstekniska tekniker . Även om dessa tidigare studier har gett vissa bidrag till organregenerering, finns det stora problem med resultaten från dessa studier, t.ex. den låga effektiviteten av organinduktion och den okontrollerbara riktningen och storleken på det regenererade organet. Med framsteg inom stamcells- och utvecklingsbiologin har reproduktionen av organogenes i fosterstadiet utvecklats under de senaste 30 åren. Utvecklingsprocessen för organregenerering börjar med induktion av organkim genom epitel-mesenkymala interaktioner i organfältet som bildas efter upprättandet av kroppsplanen under den tidiga utvecklingen. Cellmanipulationstekniker som är utformade för att regenerera organskim har utvecklats under åren, men en fullständig reproduktion av utvecklingen och regenerering av funktionella organ har inte uppnåtts .

Vi har utvecklat en bioteknisk metod, benämnd organskimmetoden, för att återskapa induktionen av organskim genom epitel- och mesenkymala interaktioner i tidiga utvecklingsstadier . Vi kompartmenterade epitel- och mesenkymceller som isolerats från musembryot med hög celltäthet i en typ I-kollagengel för att uppnå en exakt replikering av de processer som sker under organogenesen. Med hjälp av denna nya metod har vi observerat den funktionella regenereringen av flera typer av ektodermala organ, t.ex. tänder, hårsäckar och sekretoriska körtlar .

Fullt funktionella biotekniska tänder

3.1. Tandutveckling

Under tandspjälkningens utveckling förtjockas tandlaminan till en början (laminastadiet) (figur 2a). Tandgrodden utvecklas och interagerar med det orala slemhinneepitelet och mesenkymet. Därefter induceras epitelförtjockning på den framtida platsen för tanden och efterföljande epitelknoppning (knoppstadiet) till det underliggande neural crest-deriverade mesenkymet av epiteliella signaler på embryonala dagar (ED) 11-13 hos möss. Vid ED 13-15 fungerar emaljknuten som ett signalcentrum som ansvarar för bildandet och upprätthållandet av tandpapillen. De primära emaljknutarna bildas vid tandknoppen och uppträder under övergången från knopp- till kapstadiet. Vid ED 17-19 differentieras de epiteliala och mesenkymala cellerna i tandgrodden terminalt. Mesenkymet differentieras också till tandpulpan och parodontalvävnad, som kommer att bli cementum, parodontalligament och alveolärt ben. Tandrotsbildningen inleds efter bildandet av tandkronan, och de mogna tänderna bryter ut i munhålan.

3.2. Fullständigt fungerande tandregenerering

Tandförlust på grund av karies, parodontal sjukdom eller trauma orsakar grundläggande problem med korrekt oral funktion och är förknippad med orala och allmänna hälsoproblem . Konventionella tandbehandlingar som syftar till att återställa ocklusala funktioner efter tandförlust bygger på att ersätta tänderna med konstgjorda material, t.ex. fasta eller avtagbara proteser och broar. Även om dessa konstgjorda behandlingar används i stor utsträckning för att behandla tandproblem är det nödvändigt att återställa en ocklusion eftersom tänderna samordnas med den ocklusala kraften och den ortodontiska kraften från de omgivande musklerna, och det stomatognatiska systemets integritet bibehålls genom att det ocklusala systemet etableras under käkens tillväxt under den postnatala perioden . De senaste framstegen inom vävnadsregenerering har gjort det möjligt för forskare att förbättra funktionerna hos biologiska tänder genom att underlätta den underliggande tandutvecklingen genom benremodellering och hjälpa förmågan att uppfatta skadliga stimuli .

Som visats i vår tidigare studie utvecklas en biokonstruerad tandspridning till den korrekta tandstrukturen och bryter framgångsrikt ut i munhålan efter transplantation i den förlorade tandens område (figur 2b) . När det gäller en transplanterad bioteknisk mogen tagenhet som består av en mogen tand, kan parodontalligament och alveolärt ben transplanteras i den förlorade tandregionen genom benintegration i mottagaren (figur 2c) . Den biotekniska tanden upprätthåller interaktioner med parodontalligamentet och det alveolära benet som härrör från den biotekniska tagenheten genom framgångsrik benintegration. Hårdheten hos emaljen och dentinet hos de biotekniska tandkomponenterna låg inom det normala intervallet när de analyserades med hjälp av Knoop-hårdhetstestet . I framtiden kommer det att vara viktigt att kontrollera tandens form. Tänder skapas genom att vägleda mesenkymet i enlighet med kroppsplanen under utvecklingsprocessen. När det gäller den morfologiska kontrollen av tänderna styrs tandbredden av kontaktytan mellan de epiteliala och mesenkymala cellskikten, och antalet kusper styrs av uttrycket av Shhh i det inre emaljeepitelet . Denna biotekniska tandteknik bidrar till förverkligandet av regenerativ terapi med hel tandersättning som en nästa generations terapi.

Fullt fungerande bioteknisk hårfollikel

4.1. Utveckling av hårsäckar

Möss har fyra olika typer av hår på ryggen, som klassificeras som guard-, awl-, auchene- och zigzaghår. Hårfollikelutvecklingen i musens rygghud börjar med ödesbestämning av mesenkymala celler vid ungefär ED 10,5, vilket resulterar i bildandet av ett dermal kondensat. Ömsesidiga interaktioner mellan det dermala kondensatet och den överliggande epidermis leder till induktion av hårplacode (figur 3a). När hårplakoden väl är etablerad sker utvecklingen av hårsäckarna i tre vågor, som börjar med utvecklingen av vakthåret vid ED 14,5, följt av päls- och auchenehår vid ED 17 och zigzaghår vid födseln . Den nedre änden av hårpiggepitelet som omsluter en kondenserad dermalcell bildar hårmatrisens grodd. Den kondenserade dermalcellen bildar en dermal papilla, som anses vara en nisch för hårsäckens mesenkymala stamceller, och inducerar differentieringen av hårmatrisen och bildar hårsäckens inre rotskida och hårstrået. Utbuktningsregionen bildar också en nisch för epitelstamceller och ansluter samtidigt till nervfibrer och arrector pili-muskeln (figur 3a) .

4.2. Fullt fungerande regenerering av hårsäckar

Hårorganet har de biologiska funktionerna värmereglering, fysisk isolering från UV-strålning, vattentätning, taktil känsla, skydd mot skadliga stimuli, kamouflage och social kommunikation . Håravfallssjukdomar, t.ex. medfödd dysplasi av hårsäckarna och androgenetisk alopeci, är psykologiskt plågsamma och har negativa effekter på livskvaliteten hos båda könen . De nuvarande farmakologiska behandlingarna är otillräckliga för att uppnå idealisk kontroll av håravfall, t.ex. medfödd hårsäcksdysplasi eller alopecia areata . Efterfrågan på utveckling av bioteknik som möjliggör regenerativ behandling av håravfall har ökat.

I hårcykeln återskapas hårsäckskärnor med jämna mellanrum, och epiteliala och mesenkymala stamceller som kan regenerera hårsäckar finns även hos vuxna. Därför är detta organ det enda organ för vilket rekonstituerande groddar kan regenereras från celler som härstammar från vuxna. Autolog hårfollikeltransplantation där en enskild hårfollikel isoleras från den friska hårbottenregionen och transplanteras till patienter med manlig alopeci har rapporterats, och de transplanterade hårfolliklarna behåller sina egenskaper . Enligt många forskare leder ersättningen av hudceller i huden med mesenkymala celler, som samlas in från vuxna hårlökar i en hårsäck, till att nya hårsäckar bildas . Det är dock svårt att regenerera hårsäckar som fungerar i samarbete med den omgivande vävnaden. Vår grupp rekonstituerade en bioteknisk hårsäcksgrodd, som innehåller mesenkymala stamceller, med hjälp av epitelceller som härstammar från bulgarer och dermal papillaceller som isolerats inte bara från embryon utan även från vuxna möss (figur 3b) . Efter ortotopisk transplantation utvecklas de biotekniska hårsäckskimmarna till mogna hårsäckar med korrekta strukturer och producerar hår under hela sitt liv (figur 3c). De regenererade hårsäckarna anslöt sig dessutom effektivt till den omgivande värdvävnaden och uppvisade pilomotoriska reflexer som svar på administrering av acetylkolin (figur 3d). Denna studie visade på potentialen hos vävnadsstamceller som isolerats från vuxna hårsäckar att utvecklas till mänskliga hårsäckar inom området regenerativ medicin.

Fullt fungerande biotekniska sekretoriska körtlar

5.1. Utveckling av spott- och tårkörtlar

Sekretoriska körtlar, inklusive spottkörtlar och tårkörtlar, är viktiga för att skydda och bibehålla fysiologiska funktioner i mikromiljön på mun- och ögonytorna. Sekretoriska körtlar utvecklas via ömsesidiga epitel-mesenkymala interaktioner . Spottkörtlarna klassificeras i tre huvudtyper: parotiskörteln (PG), submandibulära körteln (SMG) och sublinguala körteln (SLG). SMG utvecklas genom att epitelet invagineras i den mesenkymala regionen på ED 11. Den invaginerade epitelvävnaden förökar sig och bildar en epitelstjälk (figur 4a) . En terminal knopp bildar en förgrenad struktur genom att utveckla en klyfta och genom att upprepa förlängnings- och förgreningsprocessen från ED 12,5-14,5 . De terminala knölarna differentieras till acinarceller och mognar till att syntetisera sekreterarproteiner på ED 15 . Däremot utvecklas tårkörteln också genom att epitelet invagineras i en mesenkymal säck i ett temporalt område av ögat vid ED 12,5 . De rundade epitelknopparna kondenserar till den övre konjunktivala fornixen, som sedan invagineras i det omgivande mesenkymet . Gråttkörtelns grodd bildar grenar genom förlängning av stjälken och morfogenes av klyftbildning. Den grundläggande strukturen hos tårkörteln uppnås genom ED 19 .

5.2. Regenerering av spott- och tårkörtlar

Muntorrhet och torra ögon är vanliga symtom. Sjukdomar i spottkörteln omfattar spottkörteltumörer, obstruktiva störningar, infektioner och symtom på systemiska sjukdomar, t.ex. Sjögrens syndrom, lymfom och metabola sjukdomar . Dessa sjukdomar påverkar även tårkörtlarna, vilket leder till torra ögon . Dysfunktion och störningar i samband med dessa exokrina körtlar leder till en allmän försämring av livskvaliteten. De nuvarande terapierna för sjukdomar som kännetecknas av muntorrhet och ögontorrhet behandlar dock endast symptomen . Dessa behandlingar ger endast tillfälliga effekter och vänder inte den exokrina körtelns dysfunktion.

Vår grupp syftade till att utveckla bättre behandlingar genom att återskapa en bioteknisk spottkörtelspridning från epitel- och mesenkymceller som härstammar från ED 13,5-14,5-musembryonala spottkörtelspridningar med hjälp av vår utvecklade organspridningsmetod (figur 4b) . Efter ortotopisk transplantation efter avlägsnande av naturliga spottkörtlar utvecklades den biotekniska spottkörtelgrodan till en mogen spottkörtel, och en ordentlig förbindelse bildades mellan värdspottkörteln och den biotekniska spottkörteln (figur 4b). Detta förfarande ledde till att det utvecklades en sammanhängande spottkörtelkanal i mottagarmusen med acinära vävnadsstrukturer som liknade den naturliga spottkörteln (figur 4c). Den biotekniska SMG:n regenererade serösa acinära celler och uppvisade en naturlig organstruktur. Man noterade också nervinträde i dessa biotekniska spottkörtlar, och salivsekretion inducerades i spottkörteln genom stimulering av smaklökar med citronsyra (figur 4d).

Vi rekonstituerade också en bioteknisk grötkörtelspridning från epitelceller och mesenkymala celler som härrörde från grötkörtelspridningar från ED 16,5-musembryon . Den biotekniska grodden av tårkörteln, som genererades med hjälp av organgroddmetoden, genomgick framgångsrikt en förgrenad morfogenes. Efter transplantation utvecklades dessa körtlar till mogna sekretoriska körtelstrukturer in vivo. Dessa resultat bekräftade möjligheten att regenerera en bioteknisk sekretorisk körtel med hjälp av transplantation av organgroddar.

Generering av organoider som mini-organ från pluripotenta stamceller

Organoider, som reproducerar organens partiella struktur och funktion, genererades från multipotenta stamceller baserat på konceptet att återskapa induktionsprocessen för ett organbildande fält med efterföljande självorganisering under embryonal organogenes. Denna induktion uppnåddes genom att använda olika kombinationer av cytokiner, som efterliknar mönstring och positionering av signalering i embryot. Konceptet bevisades för första gången genom den framgångsrika genereringen av en organoid av en optisk kopp från ES-celler . Därefter inducerades olika organoider i varje organbildande område, t.ex. näthinnan, hypofysen, hjärnan, innerörat och hårsäcken i huvudet, sköldkörteln och lungan i bröstkorgen samt tunntarmen, magsäcken och njurarna i buken.

Vuxna vävnadsstamceller, t.ex. tarm- , lung- , mag- och bukspottkörtelstamceller , kan också generera organoider genom självorganisering av sin nisch, som delvis kan återskapa den ursprungliga vävnadsstrukturen. Även om definitionen av en organoid skiljer sig något åt beroende på dess ursprung (dvs. pluripotenta stamceller eller vävnadsstamceller), återskapar organoider delvis organ- eller vävnadsstrukturen och kan växa till en begränsad liten storlek, och betraktas därför som miniorganer. Till skillnad från en bioteknisk organkim är en organoid därför oförmögen att helt ersätta funktionerna hos sina ursprungliga organ efter ortotopisk transplantation på egen hand; ortotopisk och heterotopisk transplantation av flera organoider kan dock delvis återskapa organfunktionerna.

Nyligen lyckades vi återskapa en fullt fungerande spottkörtel från ES-celler från möss in vivo (figur 4e,f) . Med hjälp av den allmänna metoden för organoidbildning genererade vi spottkörtelns primordium som en organoid genom induktion av ett organbildande fält (dvs. den orala ektodermen), som sedan transplanterades ortotopiskt. Den transplanterade organoiden utvecklades till en mogen spottkörtel med rätt vävnadsstruktur, t.ex. akinär vävnad, och bildade lämpliga förbindelser med omgivande vävnader, inklusive PG-kanalen och nerver. Dessutom utsöndrade den regenererade spottkörteln saliv som svar på smakstimulering med citronsyra, vilket visar att den ursprungliga spottkörtelns funktion är helt återställd efter ortotopisk transplantation av organoiden (figur 4f). Dessa studier visar tydligt att funktionell organregenerering är möjlig med hjälp av organoider som genererats genom att inducera organbildande fält i multipotenta stamceller, inte embryonala stamceller med organinducerande potential. Utveckling av ett nytt in vitro-odlingssystem som gör det möjligt för organoider av stora organ, t.ex. lever och njure, att växa till en lämplig storlek bör vara nästa forskningsämne för att uppnå organregenerering.

Regenerering av ett tredimensionellt IOS från iPS-celler

Den samordnade funktionen hos flera organ, som kollektivt kallas ett organsystem, t.ex. det centrala nervsystemet, cirkulationsorganen, matsmältningssystemet och IOS, är avgörande för att upprätthålla homeostasen i en organism . Därför är regenerering av hela organsystemet nästa utmaning inom området regenerativ medicin. IOS är det största organsystemet i kroppen. Systemet innehåller flera organ, t.ex. hårsäckar, talgkörtlar och svettkörtlar, förutom hudvävnaden som består av epidermis, dermis och subkutant fett. Hudens organsystem spelar viktiga roller i homeostasen, t.ex. utsöndring av fukt och talg samt skydd mot ultraviolett ljus och yttre stimulans genom hårstrån. Hudskador vid allvarliga brännskador är livshotande. Medfödda defekter och förlust av hudtillbehör påverkar livskvaliteten avsevärt, även om delvis regenerativ medicinsk behandling med epidermala ark är möjlig. Man har rapporterat om skapandet av artificiell hud som består av epidermis och dermis och om regenerering av hårsäcksorgan genom cellmanipulation. Inget hudorgansystem har dock regenererats.

Nu har vi framgångsrikt regenererat IOS genom att inducera ett organbildande fält i embryokroppar (EBs) som härrör från iPS-celler från mus (figur 5a) . Efter transplantation av EBs i den subrenala kapseln bekräftades generering av hudtillbehör inklusive hårsäckar, talgkörtlar och subkutan fettvävnad i den biotekniska IOS utan tumörutveckling (figur 5b,c). Dessutom var antalet och tätheten av regenererade hårstrån i den biotekniska IOS samma som i naturliga hårstrån, vilket tyder på att organogenesen i IOS skedde på ett liknande sätt som i den normala utvecklingen. Den biotekniska IOS som genererades i den subrenala kapseln var fullt funktionell efter transplantation till nakenmössens rygghud, vilket framgår av den repetitiva hårcykeln (figur 5d). Den här studien bevisade konceptet med regenerering av organsystem in vivo. Ur ett praktiskt tillämpningsperspektiv är en ny strategi för att generera ett organsystem in vitro önskvärd. En sådan strategi skulle kunna vara att sätta ihop de olika typerna av organoider som delar. Forskning för att kontrollera organoidernas konfiguration och odla dem in vitro kommer att bli nästa trend inom regenerativ medicin.

Slutsats och framtidsperspektiv

Under detta årtionde har studier av organregeneration med utgångspunkt i bioteknik gjort stora framsteg mot förverkligandet av regenerativ terapi av organ genom att införliva begrepp från stamcellsbiologi och utvecklingsbiologi. Baserat på resultaten från organoidstudier kan praktiskt taget alla mini-organ genereras från antingen pluripotenta stamceller eller vävnadsstamceller, vilket undanröjer farhågorna om cellkällan för regenerativ terapi av organ. Funktionell regenerering av ektodermala organ med hjälp av celler som isolerats från embryonala organgroddar, stamceller med organinduktiv potential och pluripotenta stamceller bevisar konceptet med organersättningsterapi.

Utvecklingen av ett tredimensionellt in vitro-kultursystem med förmåga att odla organoider och organgroddar till lämplig storlek är nödvändig för att åstadkomma funktionell regenerering av flera organ och organsystem. Nuvarande in vitro-odlingssystem möjliggör inte lämplig tillväxt eller underhåll av organoider eller organgroddar på grund av uppkomsten av nekros inuti dessa vävnader, främst på grund av bristande näringstillförsel. In vivo är blodcirkulationssystemet viktigt för att upprätthålla organens funktioner genom syretransport, tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av avfall. De senaste framstegen inom vävnadstekniken har visat att det vaskulära nätverket tillför biologiska ämnen till cellfältets inre. Dessutom har vi tidigare utvecklat ett system för organperfusionskultur med hjälp av ett kärlnätverk som upprätthåller råttleveren i ett friskt tillstånd under en längre period , vilket ger ledtrådar för utvecklingen av ett nytt tredimensionellt kultursystem.

Då hårsäcksstamceller är de enda vuxna stamcellerna som har en organinducerande potential och som kan transplanteras autogent kommer den första kliniska prövningen på människa av regenerativ terapi av organ att utan tvekan undersöka regenerering av hårsäckar. Regenerering av hårsäckar med hjälp av vår metod med organgroddar undersöks nu i en preklinisk studie för att bota patienter som lider av androgen alopeci, med målet att genomföra kliniska prövningar under 2020. Denna regenerativa behandling av hårsäckar kommer att vara en milstolpe inom regenerativa terapier för organ och kommer att leda till utveckling av material och responsiv infrastruktur för att förverkliga regenerativ medicin för organ. Genom att tillämpa kunskapen om hårfollikelregenerering och den expertis som erhållits genom kliniska försök på andra organspiror eller organoider kommer det att bli möjligt att regenerera andra organ från pluripotenta stamceller och vävnadsstamceller i kombination med organoidteknik under de närmaste decennierna.

Datatillgänglighet

Denna artikel har inga ytterligare data.

Författarnas bidrag

T.T. har utformat denna granskning. E.I., M.O., M.T. och T.T. skrev manuskriptet.

Konkurrerande intressen

Den här studien utfördes enligt ett uppfinningsavtal mellan Riken och Organ Technologies Inc. T.T. är direktör på Organ Technologies Inc.

Finansiering

Publiceringen av denna översikt stöddes delvis av ett Grant-in-Aid for KIBAN (A) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (bidrag nr 25242041) och av ett samarbetsbidrag (till T.T.) från Organ Technologies Inc. Detta arbete finansierades delvis av Organ Technologies Inc.

Fotnoter

.