Svampar som undersökts

Escovopsioides-isolat har erhållits från svampträdgårdar av olika arter av bladskärarmyror och andra myrarter som samlats in i tidigare studier. Denna samling omfattar 20 isolat från Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi och Trachymyrmex tucumanus, förutom typarten av E. nivea som erhållits från Acromyrmex subterraneus subterraneus (tabell 3). Dessutom erhölls ytterligare ett isolat från en koloni av den icke bladklippande myran Apterostigma megacephala som hittades i Parauapebas, Pará, Brasilien (tabell 3). Alla isolat uppvisade de beskrivna morfologiska egenskaperna hos släktet Escovopsioides: hyalina kolonier på PDA, terminala och interkalära vesiklar som bär på lageniforma fasor, hyalina konidier i långa kedjor, aleurokonidier och klamydosporsliknande strukturer .

Isolaten förvaras i form av konidiesuspensioner vid – 80 °C (i glycerol 10 %) och i destillerat vatten vid 10 °C i samlingen från Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo State, Brasilien. Alla isolat återupplivades från lager genom att konserverade konidier inokulerades på PDA-medium och inkuberades i 7 dagar vid 25 °C i mörker. Alla isolat som undersöktes erhölls som monosporiska kulturer.

Molekylär karakterisering av Escovopsioides

Genomiskt DNA extraherades med CTAB-metoden från kulturer som odlats på maltagar 2% (MA2%) i 5 dagar i mörker. Generna som kodar för tef1 (primers: EF6-20F och EF6A-1000R), LSU (primers: CLA-F och CLA-R) samt ITS (primers: ITS5 och ITS4) amplifierades för alla isolat. För tef1 användes 1 μL utspätt genomiskt DNA (1:100) som mall för amplifiering med hjälp av illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) under följande förhållanden: ett inledande denatureringssteg vid 94 °C i 2 minuter, följt av 15 cykler vid 94 °C i 30 s och inledande glödgningstemperatur vid 65 °C som minskar med 1 °C per touchdown-cykel och slutlig förlängning vid 72 °C i 1 minut. Ett andra PCR-steg utfördes: 94 °C i 30 s, följt av 35 cykler vid 94 °C i 30 s, 48 °C i 30 s och ett sista förlängningssteg vid 72 °C i 1 min. För ITS användes 2 μL av det utspädda genomiska DNA:t (1:100) som mall för PCR enligt de villkor som beskrivs i Schoch et al.: 94 °C i 3 minuter, följt av 35 cykler vid 94 °C per 1 minut, 55 °C i 1 minut och ett avslutande förlängningssteg vid 72 °C i 2 minuter. För LSU användes 2 μl utspätt genomiskt DNA (1:100) för PCR enligt de villkor som beskrivs i Augustin et al.: 95 °C i 2 minuter, 40 cykler med 30 s vid 95 °C, 60 s vid 62 °C, 90 s vid 72 °C och 5 min förlängning vid 72 °C. PCR-produkterna färgades med GelRed™ (Biotium) och visualiserades under UV efter elektrofores i 1 % agarosgel.

Amplikonerna renades med Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) enligt tillverkarens protokoll. Proverna analyserades i NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) och 20 ng DNA sekvenserades med BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens instruktioner. På grund av det höga GC-innehållet i ITS-regionen hos Escovopsioides tillsattes 5 % DMSO till sekvenseringsreaktionerna. Framåtriktade och bakåtriktade sekvenser genererades i ABI 3500 (Life Technologies) och sammanställdes till contigs i BioEdit v.7.1.3 . De sekvenser som genererades i den här studien har deponerats i NCBI-GenBank (Additional file 1: Table S1).

Fylogenetisk analys

Förutom de sekvenser som genererades i den här studien hämtades sekvenserna för typarten (E. nivea) tillsammans med sex beskrivna Escovopsis-arter och åtta svampar som tillhör Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma och Lecanicillium) från NCBI-GenBank. Hela datasetet som användes i den här studien bestod således av sekvenser från 37 svampar (Additional file 1: Table S1).

För den fylogenetiska analysen anpassades sekvenserna i MAFFT . Sekvenser av tef1, ITS och LSU sammanfogades i Winclada v.1.00.08. Bayesiansk inferens användes som rekonstruktionsalgoritm. Nukleotissubstitutionsmodellen GTR + G och GTR + I + G valdes för tef1 respektive ITS/LSU med hjälp av AIC i jModeltest2 med ett konfidensintervall på 95 %. Således utfördes partitionerade oberoende analyser av datasetet i MrBayes var och en med tre uppvärmda kedjor och en kall kedja. MCMC-sampling i varje analys skedde upp till en miljon generationer. Konvergens mellan uppvärmda och kalla kedjor inträffade när standardavvikelsen för splitfrekvenser var under 0,01. Därefter kasserades de första 25 % av generationerna som burn-in.

Dual-culture experiments

Vi utförde in vitro-tester för att verifiera den antagonistiska potentialen hos Escovopsioides gentemot den svamp som odlas av bladklipparmyror. Vi valde ut 13 av 21 Escovopsioides-isolat (tabell 3) utifrån följande kriterier: i) någon polymorfism som hittats i tef1-genen, ii) olika associerade myrarter, iii) geografiskt läge (dvs. olika städer och insamlingsplatser). Två av de utvalda isolaten (LESF 596 och LESF 599) hade redan utvärderats med avseende på deras interaktion med svampsorten i Varanda-Haifigs et al. studie. Vi replikerade dock denna test för att jämföra med ytterligare Escovopsioides-isolat.

Svampen Leucoagaricus gongylophorus FF2006 som odlades av myrarten Atta sexdens rubropilosa användes i de dubbelkulturella experimenten. Stammen bibehålls på agarslam genom successiva överföringar var 24:e dag vid 25 °C. Produktionen av gongylidier från denna stam kontrolleras vid varje överföringscykel. Svampen odlades på PDA-medium och inkuberades vid 25 °C i 14 dagar i mörker. Efter denna period överfördes mykelfragment (8 mm i diameter) till nya Petriplattor (90 × 15 mm) som också innehöll PDA på ett avstånd av 1,5 cm från kanten. Plattorna inkuberades vid 25 °C i 14 dagar i mörker. Därefter inokulerades mycelfragment (8 mm i diameter) av Escovopsioides, som tidigare inkuberats på PDA, på ett avstånd av 3 cm från den mutualistiska svampen. För att jämföra Escovopsioides effekter på myceltillväxten hos svampkultivarerna med de effekter som orsakas av andra svampar använde vi ett Escovopsis sp. isolat (LESF 19) från svampträdgårdarna hos Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasilien). Detta isolat erhölls genom att inokulera små bitar av svamparnas trädgårdar på PDA kompletterat med kloramfenikol. Kontrollplattor inokulerades med samma mutualistiska svamp, men inga Escovopsioides eller Escovopsis inokulerades. Alla plattor inkuberades i 14 dagar vid 25 °C i mörker. Varje kombination av Escovopsioides, Escovopsis och den mutualistiska svampen utfördes på tio plattor. Försöksplattorna och kontrollplattorna skannades med 0, 2, 3, 5, 7 och 10 dagars mellanrum på en HP Deskjet F2050-skanner. Bilderna användes för att mäta arean av kolonitillväxt (cm2) av den mutualistiska svampen i ImageJ v. 1.38 .

De myceliala tillväxtytorna av L. gongylophorus i dubbelkulturförsöken analyserades med hjälp av tvåvägs blandad ANOVA, med svampisolat (Escovopsioides och Escovopsis) jämfört med kontrollen som variabel mellan ämnena, och tid (dagar) som variabel inom ämnena, och på så sätt beakta de repeterande mätningarna av tid i behandlingarna. Uppgifterna kontrollerades med hjälp av Shapiro-Wilk-testet och Levene-testet för normalitet och homogenitet i varianserna. På grund av överträdelser av dessa kriterier transformerades uppgifterna vid behov med hjälp av log- eller kvadratroten. Multipla jämförelser med olika filamentösa svampar utfördes med hjälp av t-test med Bonferroni-korrigering.

För jämförelse mellan isolat dividerades myceltillväxtarean av L. gongylophorus i kontakt med Escovopsioides-isolat med den genomsnittliga arean av dess kontroll vid dag 10. Data kontrollerades med avseende på normalitet och homogenitet i varianserna. Envägs ANOVA utfördes med den area som erhölls dag 10 mellan alla testade svampar, med jämförelser mellan de olika behandlingarna utförda med post-hoc Tukey-HSD-test. Statistiska analyser utfördes i R v. 2.12.1 .

Bioanalyser på svampträdgårdsfragment i frånvaro av arbetare

Leucoagaricus gongylophorus odlas i attine-myrkolonier i svampträdgårdar. För att avgöra om Escovopsioides kan utvecklas på svampträdgården utan arbetarnas eventuella skyddseffekter utförde vi bioassays med fragment av detta substrat fria från myror. Fragmenten från svampträdgården kom från en mogen och frisk A. sexdens rubropilosa-koloni som underhålls vid centret för studier av sociala insekter (UNESP, Rio Claro). Svampfragment på 2 cm3 utan myror och yngel placerades i sterila petriskålar med fuktad bomull i kanterna (enligt Elizondo-Wallace et al. ). Innan experimenten genomfördes förvarades tallrikarna i 1 dag vid 25 °C för att söka efter myror som eventuellt fanns kvar i fragmenten.

Vi förberedde en 10 mL suspension av 0,05 % Tween 80 med mycelmassa och konidier av var och en av de 12 Escovopsioides (isolat LESF 591 användes inte i detta experiment) och ett Escovopsis-isolat som användes i dubbelodlingsförsöken. Denna suspension filtrerades två till tre gånger enligt Newmeyers metod för att separera konidierna från de hyferfragment som fanns i suspensionen. Därefter späddes suspensionen till 105-2.105 konidier mL-1 , bestämda i en Neubauer-kammare. Alikvantiteter på 100 μl konidiesuspensioner inokulerades på ytan av trädgårdsfragmentet med hjälp av en mikropipett. Samma mängd steril 0,05 % Tween 80-lösning tillsattes på trädgårdsytan i den negativa kontrollen. Petriskålar med svampträdgården förvarades vid 25 °C i upp till 10 dagar, med fem skålar för varje behandling och fem skålar för respektive kontroll. Den eventuella utvecklingen av hyfer hos de inokulerade svamparna observerades dagligen i ett stereomikroskop (EZ4, Leica). Escovopsioides-konidiering på svampgårdarna observerades genom att ta myceliumfragment som växte på trädgårdarna och monterades i vatten och observerades i mikroskop (DM500, Leica).

Växt- och konidieringsdata på svampgårdarna poängsattes som: ingen tillväxt (poäng 0), tillväxt som observerades endast i stereomikroskopet (poäng 1), makroskopisk tillväxt (poäng 2) och konidiering (poäng 3) under 10 dagars övervakning (Additional file 1: Figur S1). Vi observerade konidiering endast efter svampens makroskopiska tillväxt på svamparnas trädgårdar. Den totala summan av poängen för fem petriskålar varje dag erhölls och omvandlades i procent av den högsta möjliga summan för direkta jämförelser.

Effekter av Escovopsioides på trädgårdar med arbetare

Antarbetarna har en viktig roll i koloniförsvaret mot patogener och oönskade mikrober i svamparnas trädgårdar . Därför utförde vi experiment för att kontrollera påverkan av arbetare i svampträdgårdar som inokulerats med konidier av samma svampar som användes i bioassays på svampträdgårdar i avsaknad av myrarbetare (12 Escovopsioides-isolat och 1 Escovopsis-isolat).

Bioassays som använder sig av myrkolonier med drottningrätt är en utmaning på grund av det stora antal kolonier som den här typen av experiment skulle kräva. Därför utförde vi bioassays med trädgårdsfragment som innehåller arbetare för att bedöma effekterna av svampisolaten in vivo. Även om detta experimentella upplägg inte representerar vad som sker i naturliga kolonier, visade det indikativ information om arbetarnas försvarsåtgärder mot de testade svamparna. Denna bioassay anpassades efter metoden av Elizondo-Wallace et al. Plastbehållare med ett litet lager gips i botten användes för att undvika uttorkning av svamparnas trädgårdar. Ungefär 20 cm3 svampträdgård från samma koloni som användes i det tidigare försöket placerades i plastbehållarna. Försöksupplägget bestod av totalt 84 behållare, så att behandlingarna med konidier av de 13 svamparna och kontrollen hade sex behållare vardera. Vi valde ut arbetarmyror med en kapseldiameter på mellan 1,0 och 1,6 mm , sedan placerades 50 av dessa arbetarmyror i varje behållare. Arbetare med mindre än 1,0 mm räknades inte, och arbetare med mer än 1,6 mm uteslöts. Detta förfarande valdes för att möjliggöra homogenitet mellan de sex behållarna från varje behandling samt mellan behandlingarna, eftersom arbetare i intervallet mellan 1,0 och 1,6 mm har en betydande rengöringsaktivitet . Behållarens inre yta var belagd med Teflon® för att hindra myrorna från att komma undan.

Behållarna inkuberades vid 25 °C i 3 dagar för att stabilisera svamparnas trädgårdar. Konidiesuspensioner framställdes enligt beskrivningen ovan. Totalt 1 ml konidiesuspension sprutades på ytan av svampträdgårdarna med hjälp av en spruta. Svampträdgårdarna i den negativa kontrollen sprayades med endast 1 ml steril 0,05 % Tween 80-lösning.

Experimenten övervakades efter 0, 5 och 10 dagars inokulering för att kontrollera svampträdgårdarnas hälsa. Denna parameter baserades på ett poängsystem där friska trädgårdar fick poäng 0, delvis nedbrutna trädgårdar fick poäng 1 och helt nedbrutna (”infekterade”) trädgårdar fick poäng 2. Det viktigaste tecknet på att trädgårdarna försämrades var att myrorna avlägsnades från svampträdgårdarna och lades på soptippen (se tilläggsfil 1: figur S2). De poäng som erhölls från de sex behållarna i varje experiment, under de tre observationsdagarna, jämfördes med hjälp av Friedman-testet.

För att verifiera närvaron av Escovopsioides-isolat på svampträdgårdarna dag 0, 5 och 10 efter behandlingen avlägsnades fragment från trädgårdarna och inokulerades på MA2% kompletterat med 150 μg mL- 1 kloramfenikol. Plattorna inkuberades vid 25 °C i 7 dagar i mörker. Fem plattor med ett trädgårdsfragment användes för var och en av de sex behållarna från varje behandling, totalt 30 plattor per behandling. Fragment med positiv tillväxt räknades och den långsiktiga närvaron av de inokulerade svamparna i svampträdgårdarna testades med hjälp av Fisher’s Exact test. I denna analys jämförde vi andelen frangment infekterade med svampkonidier (Escovopsioides och Escovopsis) jämfört med kontrollen utan några konidier under varje försöksdag. Vi jämförde också de olika behandlingarna med inokulerade svampar med varandra under varje försöksdag.