Under det senaste decenniet har framstegen inom genomtekniken gjort det möjligt att identifiera molekylära mekanismer för biologiska processer och sjukdomar, vilket påverkar alla områden inom klinisk forskning, särskilt cancer. Intratumoral heterogenitet, dynamiska förändringar i cancercellernas genom och genetiska avvikelser är unika fingeravtryck för varje typ av cancer . Dessa egenskaper hos cancer, i kombination med prognostiska klassificeringar av subtyper och riskstratifiering, har visat att genuttrycksprofilering gör det möjligt att bättre förstå den molekylära bakgrunden till t.ex. prognos och terapikänslighet vid cancer. Dessutom är genuttrycksprofilering en kraftfull molekylär metod för att förutsäga läkemedelskänslighet .

För att generera kataloger över genomiska förändringar i olika cancertyper utvecklas samordnade storskaliga cancergenomprojekt. De två viktigaste projekten är Cancer Genome Atlas (TCGA) och International Cancer Genome Consortium (ICGC) , som omfattar många centra som använder olika plattformar för att tillhandahålla information om cancergenomik, t.ex. genuttryck, DNA-mutationer, DNA-metylering, proteinuttryck och kliniska data. Dessa projekt tillhandahåller stora mängder genomiska data för att hjälpa forskare att generera eller testa nya hypoteser som i slutändan kan bidra till utvecklingen av nya cancerterapier, diagnostiska metoder och förebyggande strategier . Det är dock en utmaning att utforska, integrera och analysera de stora mängderna komplicerade data, särskilt för forskare som saknar bakgrund inom dataprogrammering eller informatik.

Den effektiva användningen av de stora mängderna cancergenomdata förblir en utmaning på grund av begränsningarna i beräkningsmetoderna och otillräcklig vägledning. Datavisualisering är till stor hjälp för effektiv dataanalys och avancerade verktyg har utvecklats för att underlätta datavisualisering, t.ex. portalerna med öppen tillgång cBioPortal, UCSC Cancer Browser och canEvolve (tabell 1). Portaler med öppen tillgång underlättar dock främst undersökningar av stora datamängder och är ibland begränsade när man utforskar datamängderna på djupet. Här beskriver vi en enkel men effektiv metod för att undersöka delmängder av prover eller patienter med ett specifikt genetiskt, biologiskt eller kliniskt intresse. Vi fokuserar på profilering av genuttryck och presenterar en metod för analys av genuttrycksdata i förhållande till DNA-metylering och proteinuttryck (tabell 2), som kan integreras för att testa forskningshypoteser för specifika typer av cancer.

Material &metoder

Protokoll för in silico genuttrycksprofilering

Genuttrycksprofilering är en kraftfull teknik för att studera biologiska processer på molekylnivå. Genaktivitet, eller uttryck, kan bedömas genom proteinidentifiering, men genuttryck undersöks vanligen genom att undersöka RNA-meddelandet eller transkriptet. Två höggenomströmningsmetoder som vanligen används för omfattande genuttrycksprofilering är RNA-sekvensering med nästa generations sekvensering (NGS) och DNA-mikroarrays .

I allmänna termer finns det två typer av genuttrycksmetoder inom cancer: den differentiella och den relativa analysen. I den differentiella metoden belyses tumörexpressionsprofiler i förhållande till patientmatchade eller omatchade normala vävnadsprover, medan den relativa metoden jämför transkriptnivåer mellan olika tumörtyper eller cell- och vävnadsprover. Beroende på det specifika tillvägagångssättet kan genuttrycksprofilering av prover och prover ge insikter inte bara i biologi utan också ge detaljer om struktur, förändringar och variationer av transkript . Många portaler med öppen tillgång underlättar verktyg för utforskning av genuttrycksdata. Vårt protokoll illustreras med det verktyg som tillhandahålls av cBioPortal . Andra portaler med öppen tillgång, t.ex. UCSC Cancer Browser och canEvolve, kan också användas för att utforska genomiska data. Vi tillhandahåller ett steg-för-steg-protokoll i nästa kapitel (Supplemental Protocol):

	Översikt och val av cancerdataset av intresse (cBioPortal);
	Skapande av falluppsättningar/deluppsättningar av intresse i en enda studie;
	Integrativ analys av gener i en enda studie. Efter att ha definierat den intressanta cancerstudien i avsnitt 1 och skapat undergrupper av prover/patienter med kliniska eller genetiska data av intresse i avsnitt 2. Detta avsnitt klassificerar varje gen i varje prov och används för all analys och visualisering av genomiska data;
	Samling av data om genuttryck och proteinuttryck;
	Insamling av metyleringsdata;
	Korrelationsanalys. För att undersöka korrelationen mellan genuttryck och antingen metyleringsstatus eller proteinnivå tillhandahåller detta avsnitt ett verktyg för att plotta sambandet;
	Grafisk visualisering och statistisk analys. Visualisering och analys av falluppsättningar av data om mRNA-uttryck, metylering eller proteinuttryck som samlats in i avsnitt 5, eller data från korrelationsanalysen i avsnitt 6.

Resultat &diskussion

Representativa resultat

Mutationer i IDH1-genen är ancestrala händelser vid bildandet av låggradigt gliom och sekundärt glioblastom . Förekomsten av en IDH1-mutation (IDH1MUT) är förknippad med förlängd överlevnad hos gliompatienter jämfört med patienter med IDH1 vildtyp (IDH1WT) . Med hjälp av möjligheterna till kliniska resultat i cBioPortal illustreras överlevnaden i en diagram över den totala överlevnaden med ungefär sex gånger längre överlevnad för IDH1MUT-gliompatienter jämfört med IDH1WT-gliompatienter (figur 1).

IDH1MUT inducerar en metabolisk omkoppling som inte är helt förstådd, men utforskning av skillnader i uttrycksnivåerna för metaboliska enzymer är en lovande undersökningsmetod. Effekterna av IDH1MUT på uttrycket av gener som kodar för metaboliska enzymer ger en möjlighet att demonstrera möjligheterna med cBioPortal för att utföra dataintegration, utforskning och analys. TCGA erbjuder data från 112 IDH1WT- jämfört med 399 IDH1MUT-prover av låggradig gliom (LGG) och 157 IDH1WT- jämfört med nio IDH1MUT-prover av glioblastom för att undersöka och integrera för analys.

I glukosmetabolismen valdes gener som kodar för hastighetsbegränsande metaboliska enzymer: GLUT1/3, HK1, HK2, HK3, PKLR, PKM2, LDHA och LDHB. I IDH1WT jämfört med IDH1MUT LGG- och glioblastompatientprover observerades högre nivåer av genuttryck för GLUT3, HK2, PKM2 och LDHA (figur 2), vilket tyder på att IDH1WT-gliom är mer beroende av glykolys för ATP-produktion än IDH1MUT-gliom.

Då mutationer i IDH1/2 också förekommer hos 20 % av patienterna med myeloiska neoplasmer, inklusive AML, presenteras ett exempel på analys av mRNA-uttryck av de tre grupperna, IDHWT, IDH1MUT och IDH2MUT, i figur 3. Studien av akut myeloisk leukemi (AML; TCGA, Provisional) erbjuder 136 IDHWT-, 16 IDH1MUT- och 16 IDH2MUT-AML-prover för att undersöka genuttrycksprofiler. I figur 3 visas mRNA-uttrycksnivåer av ATM-genen, ett DNA-skadereaktionsprotein , i IDHWT-, IDH1MUT- och IDH2MUT AML-prover som visar att ATM mRNA-uttrycket är kraftigt minskat i IDH1MUT AML.

Ett annat exempel illustreras i figur 4, som är en plott av genuttryck kontra DNA-metylering av LDHA-genen i LGG. Lägre uttrycksnivåer av LDHA som observerades i IDH1MUT-gliom var associerade med hypermetylering av dess promotor (figur 4A), men lägre uttrycksnivåer av LDHB-genen i IDH1WT korrelerade inte med metylering (figur 4B).

För att undersöka om genuttrycksnivåer korrelerar med proteinöverflödet visas ett illustrerande exempel i figur 5. I IDH1MUT-gliom observerades lägre genuttrycksnivåer av G6PD jämfört med IDH1WT-gliom (figur 5A), medan proteinnivåerna av G6PD var lika stora i IDH1MUT och IDH1WT LGG (figur 5B), vilket tyder på att ytterligare posttranslationella mekanismer är verksamma .

Konstanta innovationer har i hög grad bidragit till att öka vår förståelse av cancer, men har också omvandlat cancerforskningen till ett av de mest dataintensiva områdena inom biologin. Välstrukturerade och organiserade cancergenomikprojekt erbjuder forskarna enorma mängder tumörprover som på liknande sätt förbereds, normaliseras och bearbetas för beräkningsanalys för att utvidga vår förståelse av cancergenetik. Det protokoll som anges här i kombination med verktyg med öppen tillgång sänker barriärerna för tillgång till dessa komplexa data och erbjuder datautvinning på djupet för att påskynda översättningen av genomiska data till nya biologiska och kliniska insikter.

Cancergenomikprojektet för gliom var ett av de första projekten inom TCGA som tillhandahöll välstrukturerade data om tumörprover från flera olika plattformar. Genomisk analys av dessa data identifierade kliniskt relevanta subtyper av glioblastom och avgränsade tre olika molekylära klasser i låggradig gliom, inklusive klassen med IDH-mutation . Portaler med öppen tillgång underlättar tillgången till dessa datamängder men är begränsade när det gäller att undersöka specifika grupper. Det protokoll som behandlas i denna artikel beskriver en enkel metod för att undersöka delmängder av prover eller patienter med ett specifikt genetiskt, biologiskt eller kliniskt intresse, t.ex. tumörprover med IDH-mutation. För det andra beskrivs i protokollet hur man genererar uttrycksprofiler av gener som är involverade i en viss väg eller process, t.ex. metabolism, i denna särskilda undergrupp av prover. Detta gör det möjligt att välja enskilda gener av intresse i stället för att utforska alla gener, och klassificerar varje gen i varje prov som används för analys och visualisering. Slutligen tillhandahålls multidimensionell analys för att undersöka genuttryck i förhållande till DNA-metylering och proteinuttryck.

Som jämförelse med andra tillgängliga verktyg använder detta protokoll webbgränssnittsverktyg som inte kräver ytterligare programvara. Ett kritiskt steg i protokollet är att välja rätt cancergenomikstudie eller projekt som innehåller de data som är av intresse. För närvarande lagrar många portaler data från dataset från litteraturen och TCGA-portalen. Som exempel kan nämnas att cBioPortal för närvarande tillhandahåller 76 cancergenomikprojekt för genuttryck (RNAseq och mikroarray) i kombination med 21 metyleringsprojekt och 41 proteinuttrycksprojekt. Validiteten i jämförelsen av genomikdata är beroende av hur väl ett prov matchas med referensen när det gäller tekniska (t.ex. typ av databehandling) och biologiska (t.ex. molekylär subtyp) bias. Därför kräver användning av portaler som tillhandahåller genomikdata från välstrukturerade cancergenomprojekt inga avancerade normaliseringstekniker och batchkorrigeringar.

Sammanfattningsvis gör vår metod det möjligt att importera och integrera en selektiv delmängd av prover med specifikt genomiskt, biologiskt eller kliniskt intresse, t.ex. genomiska förändringar, mutationer, cancersubtyper eller överlevnadsegenskaper. Metoden innehåller ett unikt koncept för att generera genuttrycksprofiler och för att korslänka dessa profiler med DNA-metylering och proteinuttryck, vilket kan integreras för att testa forskningshypoteser i specifika subtyper av cancer.

Framtidsperspektiv

Cancerforskning har utvecklats till en av de mest dataintensiva disciplinerna inom biologin. GENIE-projektet (Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange) är ett av de största helt offentliga datamängderna om cancergenomik som hittills släppts. Lätthanterliga portaler, som cBioPortal, kommer att spela en allt viktigare roll inom denna disciplin.

.