Enkla obalanserade translokationer och inversioner (klasserna A och C): ursprungsmekanismer

Det enkla resultatet av denna studie är att i 20 av 37 de novo obalanserade translokationer har duplikationen ett moderligt ursprung (fig. 1, online-resurs 1: tabell S2). Eftersom undersökningen av föräldrarnas ursprung inte var informativ eller inte möjlig i sex fall (fall 7, 14, 23, 24, 33 och 35), utgör de de novo obalanserade translokationer där den duplicerade regionen är av moderligt ursprung 64,5 % (20/31) av de fullständigt informativa fallen. Genom att kombinera dessa uppgifter med upptäckten att det i åtta av dessa fall (fall 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 och 32) finns tre alleler (Fig. 1, Online Resource 1: Tabell S2), två maternella och en paternell, fanns åtminstone i en del av duplikationsregionen, är det framväxande scenariot att i inte mindre än 25 % (8 av 31) är den primära drivkraften för förekomsten av de novo obalanserade translokationer en maternell meiotisk non-disjunktion, följt av en partiell trisomiresning av den övertaliga maternella kromosomen (fig. 1a). Den mest sannolika förklaringen till förekomsten av tre alleler inom den duplicerade regionen, två maternella och en paternell, är att det inte sker någon disjunktion vid den maternella meiosen I (mat-MI) (Fig. 1A.I). Alternativt måste en meiotisk rekombination proximalt till eller vid translokationsbrottpunkten ha föregått en non-disjunktion i moderlig meios II (mat-MII). I de 12 fallen (4-6, 10, 12, 13, 13, 17, 22, 26, 30, 34 och 37) med samma maternella duplicerade haplotyp kan andra mekanismer däremot inte uteslutas (fig. 1b), även om de också skulle kunna vara ett resultat antingen av mat-MI non-disjunction (fig. 1A.I), efter en telomeric crossing-over, i enlighet med den preferentiella förekomsten av telomeric crossovers som påvisats för vissa icke-disjoined kromosomer (Oliver et al. 2014) eller en maternell MII (mat-MII) non-disjunktion (Fig. 1A.II), som rapporterats i ett antal fall av trisomiresning (granskad i Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Det är välkänt att den övertaliga kromosomens eftersläpning i anafas, följt av att den fångas upp i en mikronukleus, ligger till grund för många kromothripsishändelser (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Som en följd av detta elimineras den övertaliga kromosomen i den ena dottercellen, medan splittringen av det mikronukleära genomiska materialet i den andra, följt av återinbäddning av alla eller vissa fragment i huvudkärnan, kan resultera i en massiv omorganisation av den ursprungliga kromosomen som antingen bibehåller det mesta av sitt material, även om det är omorganiserat i en ny ordning, eller förlorar vissa av sina delar (fig. Vilka delar av den ursprungliga övertaliga kromosomen som går förlorade och vilka som bevaras kan bero på stokastiska händelser, på de brutna ändarnas benägenhet att integreras med varandra eller med andra delar av genomet och/eller på det efterföljande urvalet av celler som kan överleva och föröka sig i närvaro av minimala segmentella obalanser. I teorin kan centriska fragment bevaras som övertaliga markeringskromosomer genom att de cirkulariseras med bildande av ringkromosomer och på så sätt överbrygga avsaknaden av telomerisk sekvens i båda ändar. Bevarandet av supernumerära interstitiella acentriska fragment kräver också att det bildas en ny centromer eller, alternativt, att fragmentet fångas upp av en annan kromosom med bildandet av en de novo insättningstranslokation. Faktum är att Kato et al. (Kato et al. 2017) nyligen rapporterade ett fall av de novo interstitiell translokation som härrör från kromothripsis av en övertalig kromosom som finns i en trisomisk zygot. Slutligen kräver bevarandet av supernumerära fragment som är utrustade med en telomer i ena änden antingen en telomerinfångning, t.ex. en translokerad supernumerär markeringskromosom som rapporterats i Vetro et al. (2012) (fall 2 och 3) eller dess infångning av en annan kromosom, mottagarkromosomen, som förlorar sin distala del och på så sätt bildar en cell med 46 kromosomer med en obalanserad de novo-translokation, som beskrivs här. Fall 6 med duplicering av samma haplotyp hos modern (fig. 1, online-resurs 1: tabell S2) visar att en kromothripsis-händelse har inträffat (fig. 1a), vilket visas av närvaron av två icke sammanhängande duplicerade regioner som är åtskilda med ~ 1,3 Mb, av vilka den interstitiella regionen har en inverterad orientering (online-resurs 2: figur S15). Chromothripsis-händelser har observerats i ett antal fall av de novo obalanserade translokationer (Weckselblatt et al. 2015), och de flesta av dem har rapporterats vara av faderligt ursprung och involvera mer än två kromosomer (Marcozzi et al. 2018). Däremot var den obalanserade translokationen i vårt fall 6 av maternellt ursprung och verkligen de novo, vilket stämmer överens med FISH-undersökningar av föräldrarnas metafaser. Dessutom, åtminstone enligt bedömningen av de högupplösta (1M) aCGH- och FISH-undersökningarna, involverade den endast två kromosomer, medan en mer komplex omarrangemang var utesluten. Det är därför frestande att spekulera i att zygoten eller det tidiga embryot var trisomiskt för kromosom 8 på grund av antingen en meiotisk eller postzygotisk maternell non-disjunktion. Efter splittringen av den övertaliga kromosom 8 återfanns endast två icke sammanhängande delar, inklusive den telomeriska delen som, när de redan var sammanfogade, förvärvades av mottagaren 18q (fig. 1a).

Modellen för bildandet av de novo obalanserade translokationerna, med utgångspunkt i en trisomisk zygot, stämmer också in på fall 24, även om vi inte kunde göra någon stödjande molekylär utredning. Förekomsten av en kvarvarande cellinje trisomisk för kromosom 9, tillsammans med en huvudinje med normal karyotyp och en tredje med den obalanserade t(14;9)-translokationen antyder dock hur det, med utgångspunkt från en trisomisk zygot, kan bildas olika cellinjer, vissa med total förlust av den övertaliga kromosomen och andra med förlust av en del av den (9p) och dess kvarvarande del (hela 9q) som fångats upp av en annan kromosom. Denna typ av mosaik med tre cellinjer har sällan dokumenterats (Phillips et al. 1997), men vid prenataldiagnostik är mosaiker med en normal cellinje och en andra med en de novo obalanserad translokation relativt vanliga och en förhöjd moderlig ålder kan påvisas i de flesta av dem (Kovaleva och Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Ett oberoende stöd för hypotesen att maternell non-disjunction är en huvudsaklig utlösande faktor för de novo obalanserade translokationer, är en ökad moderlig ålder. I våra åtta fall (fall 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 och 32), där duplikationen utan tvekan var kopplad till en maternell meiotisk non-disjunktion (två olika maternella alleler inom duplikationsregionen), dokumenterades i själva verket en ökning av den genomsnittliga moderns ålder (34,75 år, online-resurs 1: tabell S1), med hänsyn till att moderns medelålder i Italien år 2016 var 31,8 år (ISTAT, https://www.istat.it/). En ökning (33,5 år) konstaterades också i de 12 fallen (fall 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 och 37) med duplicering av samma maternella allel, vilket är förenligt med en maternell non-disjunktion som en initierande händelse. Även i de fall där dupliceringen var faderlig visades en ökning, om än mycket mer begränsad, av moderns medelålder (32,6 år), vilket möjligen tyder på att andra mekanismer än moderlig non-disjunktion kan spela en roll i bildandet av dessa obalanserade translokationer. I de fyra fall (3, 8, 29 och 36) som analyserades med hjälp av SNP-array fanns det faktiskt ingen maternell heteroisodisomi i den icke-duplicerade delen av de homologa kromosomerna (Online Resource 1: Tabell S2), vilket man skulle ha förväntat sig för en trisomisk zygot där den övertaliga faderkromosomen hade genomgått kromothripsis med räddning av endast den telomeriska delen. Om man också tar hänsyn till den försumbara frekvensen av trisomier som har sitt ursprung i felregistrering i den faderliga meiosen (Nagaoka et al. 2012) verkar förekomsten av obalanserade translokationer som antänds av en partiell trisomisk räddning av en trisomisk zygot med faderligt ursprung mycket osannolik. I stället verkar andra mekanismer, t.ex. ett nedärvt eller postzygotiskt dubbelsträngigt faderskapsbrott som måste repareras genom telomerfångst, mer rimliga (fig. 1b). Faktum är att fall 25 som är mosaisk för två cellinjer, närvarande i blod och i fibroblaster, med en terminal 2q-deletion och en derivatkromosom der(2)t(2q;14q) av faderligt ursprung (Online Resource 2:Figur S9), passar in på denna hypotes. I närvaro av en terminal deletion kan således olika reparationsmekanismer inträffa vid olika tidpunkter i olika celler i det tidiga embryot, vilket slutligen leder till ett mosaiktillstånd. I denna modell initierar den borttagna kromosomen translokationshändelsen och fungerar som mottagare, medan den duplicerade kromosomen är givare och fungerar som skadereparerande (fig. 1b). Det är dock inte möjligt att urskilja om deletionen faktiskt är den första händelsen som leder till translokationen eller om den i stället är sekundär till bildandet av en dikentrisk kromosom (fig. 1BIII och IV) som, till följd av sin asymmetriska brottning, genererar en inv-dup del-kromosom och en helt enkelt borttagen kromosom, där den sistnämnda sedan repareras genom telomerinfångning (fig. 1b). Det är möjligt att den dikentriska komponentens fortbestånd bortom de första embryonala delningarna resulterar i brott av olika storlek i de olika cellerna, som återigen repareras antingen av telomeras eller telomerfångst.

Och oavsett mekanism upptäcktes en hög prevalens av fall där båda obalanserna har samma föräldraursprung (fig. 1, online-resurs 1: tabell S2), trots att ett biparentalt ursprung för deletion och duplikation skulle kunna förväntas i hälften av fallen, enligt en postzygotisk sluthändelse. Demonstrationen av en distinkt kompartmentalisering av de två uppsättningarna föräldrakromosomer i musembryon fram till 8-cellsstadiet (Du et al. 2017) kan ge en förklaring. Eftersom denna period sammanfaller med mycket hög kromosomal instabilitet, (McCoy et al. 2017), är det frestande att spekulera i att en mekanism som t.ex. telomerinfångning, som är nödvändig för att stabilisera en tidigare strukturell abnormitet, sker på samma föräldrakromosomuppsättning som den ursprungliga anomalin. Däremot skulle ytterligare senare omjusteringar förväntas ske slumpmässigt och involvera kromosomer av båda föräldrarnas ursprung, vilket skulle leda till en obalanserad translokerad kromosom av biparentalt ursprung, vilket vi faktiskt fann i fem fall (fall 10, 12, 27, 30 och 31; Fig. 1, Online Resource 1: Table S2).

Som för klass C-rearrangemang hittade vi inte någon egenhet hos junction breakpoints som skulle kunna klargöra om deras stabilisering genom telomerinfångning av den kromosomala delen som är motsatt den borttagna beror på en annan mekanism jämfört med de fall där infångningen av telomeren är beroende av en annan kromosom. Denna analys kunde dock endast göras i två fall. Att både deletion och duplikation i fyra av fem fall var av faderligt ursprung tyder på att de härrör antingen från en ursprunglig deletion eller från brottet av en dikentrisk kromosom.

Komplexa obalanserade translokationer och inversioner (klasserna B och D)

Det råder allmän enighet om att dessa rearrangemang uppstår genom en intermediär dikentrisk, efter dess asymmetriska brott som leder till en inv-dup del och en helt enkelt raderad kromosom (Fig. 1B.III). Förvärvet av en stabiliserande telomersekvens kan ske på olika sätt: telomerasmedierat tillägg av de novo TTAGGG-sekvenser, telomerfångst av den distala delen av en annan kromosom (Yu och Graf 2010) eller av den motsatta delen av samma kromosom (Buysse et al. 2009; Fan och Siu et al. 2001), eller till och med bildandet av en ringkromosom (Rossi et al. 2008). De två translokerade inv-dup del(8p)-fall som vi kunde genotypifiera (fall 42 och 44) härstammade, som förväntat (Giglio et al. 2001), från NAHR vid mat-MI, vilket visades av närvaron av två maternella och en paternell allel i 8p-duplikationsregionen (Online Resource 1: Tabell S2). Denna återkommande onormala rekombination förmedlas av mycket identiska segmentala duplikationer som ligger vid 8p23 inom en normal och en inverterad kromosom 8 (Giglio et al. 2001). I zygoten kommer den resulterande dikentriska kromosomen sannolikt att genomgå olika brottshändelser i olika celler, vilket ibland leder till ett mosaiktillstånd med en del(8p)-cellinje och en andra cellinje med inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), eller i undantagsfall till och med en tredje cellinje med inv-dup del(8p) som slutar med den distala regionen av en annan kromosom (Pramparo 2004). Dessa mosaiker upptäcks oftare vid prenatal diagnostik, medan en enda cellinje med inv-dup del(8p), antingen translokerad eller inte, är det vanligaste fyndet åtminstone i blodet i det postnatala livet. I våra tre translokerade fall (fall 42, 43 och 44) donerades telomererna av 6q, 17p respektive Xq, alla av maternellt ursprung och med samma haplotyp för duplikation av de maternella kromosomerna 6, 17 och X, vilket förväntas för en stabiliseringshändelse som inträffade postzygotiskt. I de återstående tre fallen (fall 39, 40 och 45), som liksom alla inv-dup del-rearrangemang som inte involverar 8p, inte är återkommande, var det translokerade inv-dup av faderligt ursprung med identiska faderliga alleler i duplikationsregionen, medan telomerfångsten tillhandahölls av en kromosom som härstammar från fadern i två fall (fall 39 och 49, Online Resource 2: Figurerna S3 och S4) och en maternell i det tredje fallet (fall 45), ett foster där den translokerade kromosomen t(inv-dup5p;3q) var i mosaik med en cellinje som innehöll en icke-translokerad inv-dup del(5p) (Online Resource 2: Figur S12). Det är anmärkningsvärt att 5p-duplikationen är av olika storlek i de två cellinjerna (Online Resource 1: Tabell S1), vilket visar att den ursprungliga dikentriska kromosomen förmodligen finns i zygoten eller i det mycket tidiga embryot (Fig. 1b), genomgick olika brott i de olika cellerna, bortom embryot i klyvningsstadiet.

Identiska duplicerade alleler har rapporterats bona fide i alla inv-dup del-rearrangemang som inte involverar 8p, vilket tyder på att dessa rearrangemang har ett intrakromosomalt ursprung (Hermetz et al. 2014). Följaktligen verkar dessa inv-dup translokationsomläggningar vara slutresultatet av en inledande mitotisk händelse, möjligen i det tidiga embryot (Voet 2011), t.ex. ett dubbelsträngsbrott följt av intrasträngparning på relativt nära platser för inverterade homologa sekvenser, vilket leder till generering av den dikentriska kromosomen med en mellanliggande normalkopieringsregion (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Som redan nämnts kan den ömsesidiga produkten av inv-dup del, dvs. en borttagen kromosom, repareras och stabiliseras genom att den distala delen av en icke-homolog kromosom, eller den motsatta armen av samma kromosom, fångas in, vilket resulterar i en enkel obalanserad translokation eller inversion, vilket vi föreslår för några av de omläggningar som anges i klasserna A och C (Fig. 1b).

Brytpunktskopplingar

Sekvenseringen av brytpunktstranslokationskopplingar kunde göras i 26 fall (online-resurs 1: tabell S1, online-resurs 2: figur S1), även om kryptisk komplexitet i fyra fall (fall 4, 10, 28 och 51) försvårade en fin sekvensering. Alternativ icke-homologous end joining (alt-NHEJ) eller mikrohomologimedierad replikationsbrytande replikation (MMBIR), såsom mikrohomologier och templaterade eller icke-templaterade små inlagringar, upptäcktes i 16 fall (fall 3, 5, 6, 7, 8, 9, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 och 52) (Online-resurs 2: figur S1). Även om omarrangemanget i fallen 18 och 40 skedde inom Alu-sekvenser, visade närvaron av 5 bp kort templated insertion respektive 4 bp mikrohomologi att omarrangemanget inte genomförde en NAHR-medierad mekanism utan snarare en alt-NHEJ- eller MMBIR-mekanism. Kanonisk NHEJ (c-NHEJ, blunt ends junctions) förekom i fyra fall (fall 26, 29, 31 och 43). I fallen 2 och 38 fanns de brytpunktsbundna korsningarna vid kanten av homologa retrotransposoner (Online Resource 2: Figur S13). Detta resultat tyder på att dessa sekvenser i en minoritet av fallen underlättar reparationsmekanismer som t.ex. telomerinfångning. Även om Robberecht et al. fann att de flesta av deras de novo obalanserade translokationer förmedlades av NAHR mellan LINEs, HERVs eller segmentala duplikationer (Robberecht et al. 2013), kan vi utesluta en NAHR-händelse åtminstone i fall 2, där närvaron av två duplicerade maternella haplotyper, varav en translokeras till mottagarkromosomen, tydligt indikerar en mat-MI non-disjunction (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), vilket gör det omöjligt att tillskriva translokationen till en meiotisk händelse. Faktum är att LINE-1-medierade retrotranspositionshändelser har visat sig förekomma i somatiska celler i det tidiga mänskliga embryot, i mänskliga embryonala stamceller och åtminstone hos möss huvudsakligen under embryogenesen (för en översikt Kazazian och Moran 2017), vilket stödjer att bildandet av translokationen i våra fall också var en postzygotisk händelse.

Kombinerat tyder dessa egenskaper på att reparationsbaserade mekanismer (c-NHEJ och alt-NHEJ) och replikativa reparationsmekanismer (MMBIR) är ansvariga för att donatorkromosomen förenas med mottagarkromosomen, eller den motsatta delen av samma kromosom (fig. 1).

Genotyp-fenotypförhållande

Och även om genotyp-fenotypkorrelationer vid stora obalanserade omläggningar, som de som rapporterats i vår studie, i allmänhet är ganska grova, tillför de uppgifter vi rapporterar ytterligare några detaljer även i detta sammanhang.

De starka bevisen för att vissa obalanserade translokationer har sitt ursprung i en zygot med en övertalig kromosom som genomgår en kromothriptisk händelse, tyder på att duplikationsregionen, även om den till synes bara består av den distala regionen av den kromothriptiska kromosomen, kan innehålla fragment från andra delar, vilket är fallet i vårt fall 6 och som Weckselblatt et al. (2015) har visat. I dessa fall, om storleken på de splittrade bitarna är mindre än den som kan detekteras med array CGH, är risken att man tillskriver den onormala fenotypen endast de gener som verkar duplicerade eller borttagna, medan ytterligare morbiditet kan bero på onormalt genuttryck som genereras av TAD-avbrottet (Fukami et al. 2017).

För övrigt, i obalanserade translokationer som härrör från partiell trisomiresning, om kromotripsis skulle inträffa på den övertaliga kromosomen av faderligt ursprung, kan den följande maternella hetero/isodisomin för de återstående två kromosomerna generera ytterligare patogenicitet (Niida et al. 2018) antingen genom att till homozygot tillstånd reducera sjukdomsframkallande varianter som finns hos modern i heterozygot tillstånd, eller på grund av förekomsten av präglade gener som endast uttrycks av den faderliga allelen.

Som ett sista övervägande är det frestande att spekulera i att valet av vilken telomer som fångas upp för stabilisering av den trasiga kromosomen, kanske inte är slumpmässigt utan påverkas av avregleringen av de ursprungliga TAD:erna (Topologically Associated Domains), vilket i sin tur skapar ett gynnsamt substrat för specifika interkromosomala kontakter och rumslig 3D-kromatinkompartmentering (Dekker och Mirny et al. 2016).