Cellodling innebär i huvudsak att celler distribueras i en artificiell miljö (in vitro) som består av de nödvändiga näringsämnena, idealisk temperatur, gaser, pH-värde och luftfuktighet som krävs för att cellerna ska kunna växa och föröka sig.

• In vivo – När studien omfattar levande biologiska enheter i organismen.

• In vitro – När studien genomförs med hjälp av biologiska enheter (celler, vävnad etc.) som har isolerats från sin naturliga biologiska miljö. T.ex. vävnad eller celler som isolerats från lever eller njure.

Om vävnadsbitar kan sättas i lämplig odling för att producera celler som sedan kan användas för odling (förklarande odling), kan celler från vävnader (mjukvävnad) erhållas genom enzymreaktioner. Sådana enzymer som trypsin och proname används för att bryta ner vävnaden och frigöra de önskade cellerna.

När cellerna har erhållits direkt från organismen/djurvävnaden (eller till och med växtvävnaden) med hjälp av enzymatiska eller mekaniska tekniker kallas sådana celler för primära celler. Celler som fortsätter att föröka sig på obestämd tid (efter den första subkulturen) under särskilda förhållanden kallas emellertid cellinjer.

Dessa särskilda celler har i regel förpassats under en lång tidsperiod, vilket gör att de får homogena (likartade) genotypiska och fenotypiska egenskaper.

Morfologi

Baserat på deras utseende kan celler i kultur kategoriseras i tre huvudgrupper:

• Fibroblastisk – Detta innefattar celler som tenderar att vara bipolära/multipolära med avlånga former. Dessa celler är fästa vid substratet när de växer.

• Epitelceller – Epitelliknande celler får en polygonal form med regelbundna dimensioner. Även om de tenderar att växa i diskreta fläckar växer dessa celler också fast vid substratet.

• Lymphoblast – Dessa celler är vanligtvis sfäriska till formen och fäster inte vid substratets yta. Därför odlas de i suspension.

* För fasta plattor används stelningsmedel (t.ex. agar) när det flytande mediet används tillsammans med agar.

Cellodlingens betydelse

Cellodling är en viktig teknik inom både cell- och molekylärbiologin med tanke på att den utgör den bästa plattformen för att studera cellernas normala fysiologi och biokemi. En cell är den grundläggande strukturella, funktionella och biologiska enheten i allt levande.

För att förstå en organism eller vissa vävnader är det viktigt att förstå hur cellerna fungerar. Genom cellodling blir detta möjligt, särskilt på grund av att de primära cellerna liknar föräldracellerna från organismen/vävnaden.

Vad man än lär sig om cellerna in vitro är det representativt för vad som händer med organismen/vävnaden. Detta gör cellodlingen mycket viktig för utveckling av vacciner, screening (läkemedel etc.) och diagnos av givna sjukdomar/tillstånd.

Med tanke på att olika typer av celler kräver olika miljöer för spridning finns det olika typer av medier som används för odling, t.ex. serumfria medier och serumhaltiga medier.

När rätt förutsättningar har skapats kommer cellerna att öka i antal och kan bilda kolonier, som sedan lätt kan ses och identifieras.Allt detta kräver dock att man förstår syftet med förfarandet.

Med en god förståelse för vad förfarandet är tänkt att uppnå blir det lättare att förbereda kulturen med rätt komponenter. Genom att förstå vad förfarandet syftar till vet forskaren om han eller hon ska förbereda ett selektivt medium (som tillåter specifika celler att växa) eller ett differentiellt medium (som tillåter olika typer av celler att växa).

Primär cellodling

Cellodling är en process där celler (djur- eller växtceller) avlägsnas från organismen och förs in i en artificiell miljö med gynnsamma förhållanden för tillväxt. Detta gör det möjligt för forskare att studera och lära sig mer om cellerna.

Det finns tre huvudtyper av cellodling, vilka inkluderar:

• Primär cellodling
• Sekundär cellodling, och
• Cellinje

Här ska vi fokusera på primär cellodling.

Det finns två typer av primära celler:

Adherenta celler – Även kallade förankringsberoende celler, dessa är den typ av celler som behöver fästas för att växa. Adherenta celler är orörliga och erhålls från organ som njurar.

Suspensionsceller – Detta är den typ av celler som inte behöver fästas för att växa. De kallas därför också för förankringsoberoende celler och omfattar sådana celler som lymfocyter som finns i blodsystemet.

I primär cellodling förs celler som erhållits från sådana föräldravävnader (levande vävnader) som lever och njure in i lämpliga medier för tillväxt. När cellerna väl har erhållits kan de antingen odlas som explantationsodlingar, suspensioner eller monolager.

* Vid primär cellodling måste cellerna ha erhållits från föräldravävnaden/den levande vävnaden. Det innebär att de inte kommer från en annan odlingsprocess.

Innan cellerna odlas utsätts de först för enzymatisk behandling för att separeras. Detta måste dock ske under en minimal tid för att undvika att cellerna skadas eller dödas. När enskilda celler har erhållits odlas de sedan på lämpligt sätt i media för att de ska kunna växa (dela sig) och nå önskat antal.

Initialt tenderar kulturen att vara heterogen, eftersom den består av olika typer av celler som erhållits från vävnaden.Även om detta kan upprätthållas genom in vitro-processen (i en kultur i ett lämpligt medium) skulle detta endast vara under en begränsad tidsperiod.

Genom transformationsprocessen kan de primära cellerna användas under en lång tidsperiod, vilket förändrar kulturen med tiden. Dessa celler kallas kontinuerliga cellinjer.

Primärceller föredras dock vanligen framför kontinuerliga cellinjer eftersom de är mer lika (fysiologiskt) invivoceller (celler från levande vävnad). Dessutom kan kontinuerliga cellinjer genomgå vissa förändringar (fenotypiska och genotypiska förändringar) som kan leda till avvikelser under analysen. De kan därför inte användas för att avgöra vad som händer med in vivo-cellerna. Det är av denna anledning som primära celler är att föredra.

Med tanke på att de primära cellerna i hög grad liknar de celler som erhålls från levande vävnad är de viktiga för forskningsändamål eftersom de kan användas för att studera deras funktioner, metaboliska regleringar, cellfysiologi, utveckling, defekter och tillstånd som påverkar den aktuella vävnaden.

Och de används bland annat för vaccinproduktion, genteknisk läkemedelsscreening, toxicitetstestning och fosterdiagnostik.

Cellodlingsmedier

I cellodlingstekniker avlägsnas celler (eller vävnader)från en växt eller ett djur och förs in i en ny, konstgjord miljö som kan stödja deras spridning (överlevnad och tillväxt).

Några av de krav som ställs på en sådan miljö för att cellerna ska kunna föröka sig är bl.a. följande:

• Ett substrat (näringskälla)
• Ett lämpligt temperaturintervall (kontrollerat)
• Växtmedium, och
• Ett lämpligt pH-värde, bland annat

Här, ska vi fokusera på mediet (cellodlingsmedia)

Och även om det finns olika typer av odlingsmedia (för olika typer av celler) består de vanligtvis av:

• Glukos
• Aminosyror
• Vitaminer
• Organiska salter
• Fästningsfaktorer Etc.

Det finns två huvudtyper av odlingsmedier:

Naturliga medier – Naturliga odlingsmedier består av biologiska vätskor som är naturligt förekommande. Även om denna typ av media kan användas för en rad olika celler är dess största nackdel att den kan sakna de exakta komponenter som krävs för vissa celler, vilket i hög grad kan påverka reproducerbarheten.

Artificiell media – Även kallad syntetisk media, artificiell media hänvisar till den typ av media som produceras genom att tillsätta sådana näringsämnen som vitaminer, gaser (syre och koldioxid) och protein med mera. Dessa organiska och oorganiska näringsämnen tillsätts för att tillgodose de specifika behoven hos vissa celler och på så sätt skapa en idealisk miljö för deras tillväxt.

Som sådana kan de användas för ett antal ändamål, bland annat:

• Gör omedelbar överlevnad av cellerna
• Gör möjlighet till förlängd överlevnad av cellerna
• Gör möjlighet till obegränsad tillväxt av cellerna
• Gör möjlighet till specialiserade funktioner

Å andra sidan kan odling kategoriseras som:

Selektiva medier – Detta är en speciell typ av medier som endast tillåter vissa celler att växa. Till exempel kan blodagar (som används för att isolera Streptococcus & Moraxella-arter) förvandlas till ett selektivt medium genom att tillsätta antibiotika.

Differentiella medier – Denna typ av medier tillåter olika typer av celler/mikroorganismer att växa beroende på deras ämnesomsättning.

Som nämnts ovan framställs olika typer av syntetiska medier på ett sådant sätt att de ger den idealiska spridningsmiljön för vissa celler. Av denna anledning kan syntetiska medier delas in i fyra huvudkategorier.

Dessa inkluderar:

Serumhaltiga medier – I dessa typer av medier används serum (fetalt bovint serum) som bärare för bland annat näringsämnen och tillväxtfaktorer som tenderar att vara vattenolösliga.

Serumfria medier – Dessa typer av medier produceras vanligen för att stödja odling av en enskild celltyp och tillhandahåller därför specificerade näringsämnen och andra faktorer som krävs av celltypen. I dessa medier saknas serum eftersom det har vissa nackdelar och kan leda till misstolkning av immunologiska resultat.

Kemiskt definierade medier – Som namnet antyder består denna typ av medier av föroreningsfria rena organiska och oorganiska beståndsdelar. Beståndsdelarna i denna typ av medier produceras vanligtvis genom genteknik i bakterier eller jäst.

Proteinfria medier – Proteinfria medier saknar typiskt sett alla typer av proteiner. Det används till stor del för att främja bättre tillväxt av cellerna samt proteinuttryck utöver att underlätta för rening av alla uttryckta produkter.

Några av de viktigaste komponenterna i cellodlingsmedia inkluderar:

• Näringsämnen – tillhandahålls genom peptider och aminosyror, som är byggstenar för proteiner
• Kolhydrater för energi
• Väsentliga mineraler som kalcium, magnesium, fosfater och järn, bland annat buffertmedel som acetater för att stabilisera odlingsmediet
• Vitaminer
• PH-förändringsindikatorer som fenolrött

Cellodlingsmedier används för spridning av celler, som sedan kan identifieras och studeras. De kan användas för olika ändamål, bland annat för utbildning, diagnos och behandling av sjukdomar.

Cellsuspension

I odlingsmetoder hänvisar cellsuspension till en typ av odling där celler är suspenderade i ett flytande medium.

För att få fram enskilda celler sätts ett sprött kallus (liten vävnad som lätt faller sönder) i ett omrört flytande medium (omrörning möjliggör utbyte av gaser till skillnad från fast medium), vilket bryter upp det. Detta gör det möjligt att frigöra enskilda celler som sedan överförs till ett annat färskt medium.

Cellsuspensionskulturer har en stor fördel jämfört med stationära kulturer, eftersom de gör det möjligt att bada cellerna på ett jämnt sätt. Med tanke på att mediet tenderar att omröras, möjliggörs dessutom luftning av mediet, vilket ger gas till cellerna. Eftersom mediet är en suspension blir det också lätt att manipulera kulturens innehåll.

Som alla andra kulturer måste suspensionskulturer ske under kontrollerade förhållanden, vilket ger cellerna en idealisk miljö för att föröka sig. När de når ungefär 80 procent konfluens är det dags att subkulturera för att säkerställa fortsatt god tillväxt.

* 80 procent konfluens avser det tillstånd där80 procent av kulturytan är täckt av de växande cellerna.

I vissa fall kan de suspenderade cellernahäftas på odlingskolvarnas plastyta eller till och med bilda klumpar. I sådana fall kan en pipett användas för att plocka upp dessa celler och driva ut dem på kolvens yta och därmed bort från plastytan. Detta gör det lättare att få fram enskilda celler eftersom de inte fastnar på plastytan.

Röda blodkroppar i suspension

• (vänster: utan hemolys) Suspensionen av röda blodkroppar (0,5 % röda blodkroppar från får i koksaltlösning) är röd och ogenomskinlig.
• (mitten: utan hemolys) De röda blodkropparna sedimenterade spontant under 60 minuter. Observera att supernatanten inte är färgad.
• (höger: hemolys) RBC-suspension som behandlats med hemolysin från S. pyogenes vid 37C i 30 min, blir genomskinlig genom hemolys.

Se mer om röda blodkroppar

Räkna celler

Att räkna antalet celler i en suspension är en process som involverar användning av en färgning. När till exempel trypanblått används tränger det in i de döda cellernas cellmembran, men inte i de levande cellerna.

Cellerna stöts sedan försiktigt ut i en hemocytometer (som innehåller räknekammaren) under täckglaset och observeras i ett mikroskop. Cellerna räknas sedan inom ett givet antal rutor för beräkningar.

Betydelse

Denna metod är till stor del att föredra på grund av att den gör det möjligt för cellerna att suspenderas i en lösning i stället för att hållas i ett fast medium. Här blir det därför lättare att manipulera innehållet och därmed förhindra att de bildar kluster. Med cellsuspensioner är det också lättare att observera enskilda celler i mikroskopet.

I detta fall blir det möjligt att inte bara studera cellernas struktur utan också se hur väl de har differentierats, genom att titta på döda och levande celler i mikroskopet.

Cellodlingsprotokoll

Cellodlingsprotokoll är till för att se till att odlingsförfarandena utförs enligt de standarder som krävs. Detta är inte bara avsett att förhindra att cellerna kontamineras, utan också att se till att forskarna själva skyddas från alla former av kontaminering.

För övrigt förväntas arbetets art överensstämma med lämpliga etiska riktlinjer. Det är därför viktigt att först och främst se till att hela förfarandet är förenligt med både de medicinska etiska riktlinjerna och riktlinjerna för djurförsök. Detta beror på att om man bryter mot sådan lagstiftning och sådana riktlinjer kan det leda till hårda straff och till och med till att laboratoriet stängs.

För att påbörja arbetet ska man genomföra följande förfarande:

• Säkerställa att arbetsområdet är desinficerat (med 70 procent etanol)
• Använd alltid ett par nya handskar. Om ett par handskar måste användas för ett annat cellodlingsförfarande ska de desinficeras med 70-procentig etanol och lufttorkas.
• Alla utrustningar som tagits ut ur skåpet bör också desinficeras för att förhindra kontaminering
• Sådana utrustningar som pipetter, glasburkar och plast som ska användas för förfarandet bör autoklaveras

Och även om det finns ett brett utbud av odlingsmedier för celler, är det viktigt att komma ihåg att cellkulturer, särskilt primära cellkulturer, är lätt att kontaminera och att de dessutom riskerar att innehålla oupptäckta virus. Därför bör allt material hanteras som potentiellt smittsamt för att undvika infektioner.

För säkerhets skull bör arbete med cellkulturer dessutom utföras i en lämplig laminarflödeshuv, där luften leds bort från forskaren.

Protokoll för beredning av cellodling

Kontrollera alltid informationen på behållaren för att se till att mediet är lämpligt för den cell som ska odlas,

när det väl är berett,

Kontrollera kulturen var 30-48:e timme och kontrollera att den är konfluent (när cellerna helt täcker kulturens yta) – Detta beror dock till stor del på typen av celler.

När förfarandet är avslutat och cellerna har analyserats ska kulturen kasseras på lämpligt sätt. Här är det viktigt att vara mycket försiktig med tanke på att cellerna vid denna tidpunkt redan har förökat sig och ökat i antal. Dessutom finns det stora chanser att provet har förorenats, vilket ökar riskerna för att orsaka infektioner hos forskaren om det inte hanteras på lämpligt sätt.

Bortskaffande

• För sådana föremål som skalpeller, glasobjektsglas och täckglas med mera kan avkontaminering innebära autoklavering vid 121 grader Celsius och 15 psi (tryck) i minst 30 minuter. Om de skall kasseras är det dock viktigt att de läggs i en plastpåse och i lämplig behållare för att senare förbrännas.
• Med flytande avfall är kemisk desinficering en av de bästa metoderna för att aktivera avfallsprodukten. Kemikalier som blekmedel kan användas för detta ändamål innan vätskan hälls ner i avloppet.
• För fasta avfallsprodukter samlas de i en plastpåse för förbränning. Å andra sidan kan de först autoklaveras innan de förbränns.

Slutsats

I allmänhet innebär cellodling, oavsett om man använder en suspension eller ett stationärt medium, att cellerna växer i en artificiell miljö med gynnsamma förhållanden. En enzymatisk verkan kan användas för att få fram celler för odling, men det är den mekaniska uppdelningsmetoden som är mest föredragen eftersom den ger ett enklare och mindre traumatiskt sätt att få fram celler.

Denna metod innebär helt enkelt att en vävnad skärs upp i mindre bitar, varifrån de utspillda cellerna sedan samlas in. Även tekniken med primära explanter kan användas för att få fram cellerna. Denna metod är dock mest användbar för uppdelning av mindre mängder vävnad.

Alla celler kan användas i kulturer för att observera deras beteende, men embryonala vävnader är att föredra (för primära celler) jämfört med vuxna celler eftersom de ger celler som är mer livskraftiga och som snabbt kan föröka sig.

Här är det också viktigt att se till att cellerna är av högre kvantitet, eftersom deras överlevnadsfrekvens tenderar att vara lägre i jämförelse med subkulturerna. I

För att öka kulturernas framgång är det också viktigt att se till att skadorna på cellerna minimeras både vid insamling och bearbetning av cellerna. Detta är utöver att använda ett lämpligt medium för cellerna i fråga.

I samma anda kan du ta en titt på typer och tekniker för vävnadskulturer.

Kolla in MicroscopeMasters val av mikroskoptillbehör.

Såväl som information om celldelning, celldifferentiering och cellfärgning och få en inblick i cellteori.

För de mer avancerade och en bra läsning är Molecular Biology of the Cell. Samt lära dig mer om cytokemi.

Kanske är du student, lärare eller hobbyist och vill följa MicroscopeMasters information om roliga mikroskopexperiment.

Se även Mikroskopikultur och Känslighetstestning

Tillbaka från Cellkultur till Cellbiologins huvudsida

Tillbaka från Cellkultur till MicroscopeMaster Home

.