3 amylashämmare

α-amylas (1,4-α-d-glukan-glukanhydrolas, EC3.2.1.1) är ett endoglukanas som katalyserar hydrolysen av endo α-(1,4)-glykosidbindningarna i stärkelse och relaterade polysackarider. Hydrolysen av stärkelse katalyseras först av α-amylas som finns i människans saliv följt av pankreasamylas i duodenum. Human pankreatiskt α-amylas (HPA) är ett viktigt farmakologiskt mål för behandling av typ 2-diabetes. Kostnaden för HPA är dock relativt hög för forskningsändamål. I stället används svinpankreas α-amylas (PPA) vid in vitro matsmältningsmätning. PPA består av 496 aminosyrarester och visar 83 % identitet med sin mänskliga motsvarighet HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA är ett endo-typ amylas och katalyserar hydrolysen av interna α-(1,4)-glykosidbindningar i amylos och amylopektin genom multipla angrepp mot den icke-reducerande änden (Robyt & French, 1970). Hydrolysprodukterna från α-amylas från porcins pankreas α-amylas är huvudsakligen maltos, maltotrios och maltotetraos (Yook & Robyt, 2002). PPA har två isomerer PPA isozym-I (PPA-I) och PPA-II, som har samma molekylvikt men skiljer sig något i aminosyrasammansättning och isoelektrisk punkt (Pasero et al., 1986).

Naturligt förekommande α-amylashämmare inkluderar proteinbaserade sådana och sekundära metaboliter. De förstnämnda ligger utanför ramen för denna artikel eftersom de tenderar att denatureras vid termisk eller sur (magsyra) behandling och förlorar sin aktivitet när de når tunntarmen. Här sammanfattar vi den senaste litteraturen om α-amylashämmare. De metoder som används för att mäta deras hämmande aktivitet anges också eftersom olika metoder kan resultera i olika IC50-värden. I jämförelse med α-glukosidas finns färre rapporter om α-amylas och de flesta studierna handlar om polyfenoler.

Isookanin (57) (Fig. 3.8) isolerat från spanska nålar, Bidens bipinnata, uppvisade en måttlig hämmande aktivitet på HPA (IC50 på 0,447 mg/ml eller 156 μM) som uppmättes med hjälp av jodometrisk analys (Yang et al., 2012). Det bör noteras att isookanin innehåller två katekoliska enheter, och därmed förväntas det vara en bra reduktant, vilket kan reducera jod som orsakar falskt positiva resultat.

Figur 3.8. Kemiska strukturer för amylashämmare, föreningarna 57-59, 5-kaffeoylkinesyra och 4,5-dicaffeoylkinesyra.

Från bladet av vattenkrasse (Syzygium aqueum) blad, myricetin-3-O-rhamnosid (9) och europetin-3-O-rhamnosid (10) (fig. 3.2) isolerades, och inhiberingsaktiviteten på α-amylashämning mättes med hjälp av DNSA-analys för att vara 10 gånger (EC50 på ~ 2,0 μM) starkare än acarbose (EC50 på 19 μM). En så hög aktivitet ses ganska sällan i polyfenoliska föreningar och motiverar ytterligare undersökningar, särskilt när det gäller dess hämmningsmekanism och selektivitet när dessa föreningar utmanas av komplexa livsmedelsmatriser. Myricetin är en stark radikalfångare och därför är stabiliteten hos 9 och 10 också ett problem. Författarna rapporterade att quercetin hade en jämförbar EC50 (17 μM) med acarbose (19 μM). Med hjälp av den turbiditetsanalys som vi utvecklat i vårt laboratorium kunde vi inte påvisa någon hämmande aktivitet hos quercetin mot pankreatiskt α-amylas med acarbose som referensstandard (Huang et al., opublicerade resultat). Därför måste det verifieras om den EC50 som rapporteras är metodberoende för att utesluta eventuella artefakter (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus tillhör också familjen Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi och Lu (2012) isolerade och renade 2′4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′5′-dimetylchalcon (DMC) från de torkade blomknopparna av C. operculatus. Föreningen uppvisade en icke-kompetitiv hämningsmekanism mot PPA (Hu et al., 2012).

Tilirosid (58) (Fig. 3.8), isolerad från fröna av hundrosen, Rosa canina L., hämmar PPA med IC50 på 280 mM, och en kinetisk studie visar att det är en icke-kompetitiv hämmare med Ki värden på 84,2 μM kvantifierad med p-nitrofenyl-alpha-d-pentaglukosid som substrat. Till skillnad från acarbose visar tilirosid ingen hämmande aktivitet mot α-glukosidas. Kanske på grund av dess svaga α-amylashämmande aktivitet i djurmodellen krävs högdos tilirosid (600 mg/kg) för att minska den postprandiala plasmaglukoskoncentrationen hos möss som behandlats med stärkelse vid 2 g/kg. Tilirosid kan uppvisa antihyperglykemi genom hämning av både natriumberoende glukostransportör 1 och glukostransportör 2 medierat glukosupptag i enterocyter (Goto et al., 2012).

Curcumin och dess derivat har föreslagits vara multitargeting föreningar som har ett mycket brett spektrum av hälsofördelar. Som ett potentiellt medel för att mildra stärkelsesmältningshastigheten har bisdemetoxikurcumin (59) (fig. 3.8) från rhizomet av Curcuma longa HPA- och PPA-hämningsaktivitet med IC50-värden på cirka 25 μM med hjälp av DNSA-assay. Kinetisk studie visar att det är en icke-kompetitiv hämmare av HPA med ett skenbart Ki på 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- och disubstituerade caffeoylkinesyror är de viktigaste polyfenolföreningarna som finns i gröna kaffebönor. På grund av närvaron av tre sekundära hydroxylgrupper i kinasyraringen finns det tre interkonverterande positionsisomerer av monosubstituerade caffeoylkinesyror och tre dicaffeoylkinesyror, som alla renades från gröna kaffebönor. Deras hämmande aktivitet på PPA-I (Narita & Inouye, 2011) mättes med hjälp av p-nitrofenyldiglukosid, som producerar p-nitrofenol och maltos vid hydrolys. Det är anmärkningsvärt att den hämmande aktiviteten är starkt beroende av positionen för caffeoylgrupperna i monokaffeoylkinesyra. 5kaffeoylkinesyra (eller allmänt känd som klorogensyra) (fig. 3.8) har den högre hämmande aktiviteten med IC50 på 80 μM, jämfört med 4-kaffeoylkinesyra (120 μM) och 3-kaffeoylkinesyra (230 μM). För de tre dicaffeoylkinkinsyraisomerer är den hämmande aktiviteten mycket högre och är inte lika känsliga för estergruppernas position eftersom 3,4- och 4,5-dicaffeoylkinkinsyror (fig. 3.8) har samma IC50-värden (20 mM), och 4,5-dicaffeoylkinkinsyra har en IC50 på 30 μM (Narita & Inouye, 2011).