Translocațiile și inversiunile dezechilibrate simple (clasele A și C): mecanisme de origine
Rezultatul direct al acestui studiu este că în 20 din 37 de translocații dezechilibrate de novo, duplicarea are o origine maternă (Fig. 1, Resursă online 1: Tabelul S2). Deoarece investigarea originii parentale nu a fost informativă sau nu a fost posibilă în șase cazuri (cazurile 7, 14, 23, 24, 33 și 35), translocațiile dezechilibrate de novo în care regiunea duplicată este de origine maternă reprezintă 64,5 % (20/31) din cazurile complet informative. Combinând aceste date cu constatarea că în opt dintre aceste cazuri (cazurile 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 și 32) trei alele (Fig. 1, Resursă online 1: Tabelul S2), două materne și una paternă, au fost prezente cel puțin în cel puțin o parte din regiunea de duplicare, scenariul care se conturează este că, în nu mai puțin de 25 % (8 din 31), principalul factor determinant pentru apariția translocațiilor dezechilibrate de novo este o nondisjuncție meiotică maternă, urmată de o trisomie parțială de salvare a cromozomului matern supranumerar (Fig. 1a). Cea mai probabilă explicație pentru prezența a trei alele în cadrul regiunii duplicate, două materne și una paternă, ar fi non-disjuncția la meioza maternă I (mat-MI) (Fig. 1A.I). Alternativ, o recombinare meiotică proximală sau la punctul de ruptură al translocației trebuie să fi precedat o nedisjuncție în meioza maternă II (mat-MII). În schimb, în cele 12 cazuri (4-6, 10, 12, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 și 37) cu același haplotip matern duplicat nu pot fi excluse alte mecanisme (Fig. 1b), deși acestea ar putea rezulta fie din non-disjuncția mat-MI (Fig. 1A.I), fie după o încrucișare telomerică, în conformitate cu apariția preferențială a încrucișărilor telomerice demonstrată pentru unii cromozomi non-disjuncți (Oliver et al. 2014) sau o non-disjuncție MII maternă (mat-MII) (Fig. 1A.II), așa cum a fost raportat într-un număr de cazuri de salvare a trisomiei (revizuit în Chantot-Bastaraud et al. 2017).
Este bine cunoscut faptul că întârzierea în anafază a cromozomului supranumerar, urmată de prinderea acestuia în cadrul unui micronucleu, stă la baza multor evenimente de cromotripsie (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). În consecință, într-o celulă fiică, cromozomul supranumerar este eliminat, în timp ce în cealaltă celulă, spargerea materialului genomic micronuclear, urmată de reîncorporarea tuturor sau a unor fragmente în interiorul nucleului principal poate avea ca rezultat o reorganizare masivă a cromozomului original care fie își păstrează cea mai mare parte a materialului său, deși reorganizat într-o nouă ordine, fie își pierde o parte din porțiuni (Fig. 1a), ce porțiuni ale cromozomului supranumerar original se pierd și care se păstrează ar putea depinde de evenimente stocastice, de predispoziția capetelor rupte de a se integra între ele sau cu alte părți ale genomului și/sau de selecția ulterioară a celulelor care pot supraviețui și se pot multiplica în prezența unor dezechilibre segmentare minime. În teorie, fragmentele centrice pot fi păstrate ca cromozomi marker supranumerari prin circularizarea lor cu formarea de cromozomi inelari, depășind astfel absența secvenței telomerice la ambele capete. Conservarea fragmentelor acentrice interstițiale supranumerare necesită și formarea unui neocentromer sau, alternativ, capturarea fragmentului de către un alt cromozom cu formarea unei translocații inserționale de novo. Într-adevăr, Kato et al. (Kato et al. 2017) au raportat recent un caz de translocație interstițială de novo derivată prin cromotripsie a unui cromozom supranumerar prezent într-un zigot trisomic. În cele din urmă, conservarea fragmentelor supranumerare echipate cu un telomer la un capăt necesită fie o captare a telomerului, de exemplu, un cromozom marker supranumerar translocat, așa cum au raportat Vetro et al. (2012) (cazurile 2 și 3), fie captarea acestuia de către un alt cromozom, cel receptor, care își pierde porțiunea distală, formând astfel o celulă cu 46 de cromozomi cu o translocație de novo dezechilibrată, așa cum este descrisă aici. Într-adevăr, cazul 6 cu duplicarea aceluiași haplotip matern (Fig. 1, Resursă online 1: Tabelul S2) ilustrează apariția unui eveniment de cromotripsie (Fig. 1a), după cum arată prezența a două regiuni duplicate necontinue separate de ~ 1,3 Mb, dintre care cea interstițială are o orientare inversată (Resursă online 2: Figura S15). Evenimentele de chromothripsis au fost observate într-o serie de cazuri de translocații dezechilibrate de novo (Weckselblatt et al. 2015), iar cele mai multe dintre acestea au fost raportate ca fiind de origine paternă și ca implicând mai mult de doi cromozomi (Marcozzi et al. 2018). În schimb, translocația dezechilibrată din cazul nostru 6 a fost de origine maternă și, într-adevăr, de novo, în concordanță cu investigațiile FISH ale metafazelor parentale. Mai mult decât atât, cel puțin așa cum a fost judecat de investigațiile aCGH de înaltă rezoluție (1M) și FISH, a implicat doar doi cromozomi, în timp ce o rearanjare mai complexă a fost exclusă. Prin urmare, este tentant să se speculeze că zigotul sau embrionul timpuriu a fost trisomic pentru cromozomul 8 din cauza unei non-disjuncții materne meiotice sau postzigotice. Spargerea cromozomului 8 supranumerar a fost urmată de recuperarea a doar două porțiuni necontinue, inclusiv a celei telomerice, care, atunci când au fost deja cusute la loc, au fost achiziționate de către receptorul 18q (Fig. 1a).
Modelul de formare a translocațiilor dezechilibrate de novo, pornind de la un zigot trisomic, se potrivește, de asemenea, cu cazul 24, deși nu am putut efectua nicio investigație moleculară de susținere. Cu toate acestea, prezența unei linii celulare reziduale trisomice pentru cromozomul 9, alături de o linie principală cu cariotip normal și o a treia cu translocația dezechilibrată t(14;9) sugerează modul în care, pornind de la un zigot trisomic, se pot forma diverse linii celulare, unele cu pierderea totală a cromozomului supranumerar, iar altele cu pierderea unei părți a acestuia (9p) și porțiunea reziduală a acestuia (întregul 9q) captată de un alt cromozom. Acest tip de mozaic cu trei linii celulare au fost rareori documentate (Phillips et al. 1997), dar în diagnosticul prenatal mozaicurile cu o linie celulară normală și o a doua cu o translocație dezechilibrată de novo sunt relativ frecvente și o vârstă maternă crescută poate fi detectată în cele mai multe dintre ele (Kovaleva și Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).
Un sprijin independent pentru ipoteza că non-disjuncția maternă este un factor principal de declanșare a translocațiilor dezechilibrate de novo, este vârsta maternă crescută. Într-adevăr, în cele opt cazuri ale noastre (cazurile 1, 2, 9, 11, 11, 15, 19, 28 și 32), în care duplicarea a fost fără îndoială legată de o non-disjuncție meiotică maternă (două alele materne diferite în cadrul regiunii de duplicare), a fost documentată o creștere a vârstei medii materne (34,75 ani, Resursă online 1: Tabelul S1), ținând cont de faptul că vârsta maternă medie în Italia în 2016 a fost de 31,8 ani (ISTAT, https://www.istat.it/). O creștere (33,5 ani) a fost, de asemenea, recunoscută în cele 12 cazuri (cazurile 4, 5, 6, 10, 12, 13, 13, 17, 22, 26, 30, 34 și 37) cu duplicare a aceleiași alele materne, compatibilă cu o non-disjuncție maternă ca eveniment inițiator. Chiar și în cazurile în care duplicarea a fost paternă, s-a înregistrat o creștere, deși mult mai limitată, a vârstei medii materne (32,6 ani), ceea ce poate indica faptul că alte mecanisme decât non-disjuncția maternă pot juca un rol în formarea acestor translocații dezechilibrate. Într-adevăr, în cele patru cazuri (3, 8, 29 și 36) analizate prin matrice SNP nu a fost prezentă nicio hetero-izodisomie maternă în porțiunea neduplicată a cromozomilor omologi (Resursă online 1: Tabelul S2), așa cum ne-am fi așteptat pentru un zigot trisomic în care cromozomul paternal supranumerar a suferit o cromotipare cu salvarea doar a porțiunii telomerice. Astfel, luând în considerare, de asemenea, frecvența neglijabilă a trisomiei provenite din segregarea greșită în meioza paternă (Nagaoka et al. 2012), apariția translocațiilor dezechilibrate declanșate de salvarea trisomică parțială a unui zigot trisomic de origine paternă pare foarte puțin probabilă. În schimb, par mai plauzibile alte mecanisme, cum ar fi o ruptură paternă ereditară sau postzigotică cu dublu catenar care necesită a fi reparată prin capturarea telomerilor (Fig. 1b). Într-adevăr, cazul 25, care este mozaic pentru două linii celulare, prezente în sânge și în fibroblaste, cu o deleție 2q terminală și un cromozom derivat der(2)t(2q;14q) de origine paternă (Resursă online 2:Figura S9), se potrivește cu această ipoteză. Astfel, în prezența unei deleții terminale, diferite mecanisme de reparare pot apărea în momente diferite în diferite celule ale embrionului timpuriu, ducând în cele din urmă la o stare mozaicată. În acest model, cromozomul șters inițiază evenimentul de translocație, acționând ca unul receptor, în timp ce cromozomul duplicat este donator, funcționând ca reparator de leziuni (Fig. 1b). Cu toate acestea, nu este posibil să se discearnă dacă deleția este de fapt primul eveniment care duce la translocație sau este, în schimb, secundară formării unui cromozom dicentric (Fig. 1BIII și IV) care, ca urmare a ruperii sale asimetrice, generează un cromozom inv-dup del și unul pur și simplu deletat, acesta din urmă fiind apoi reparat prin capturarea telomerului (Fig. 1b). Este posibil ca persistența dicentricului dincolo de primele diviziuni embrionare să rezulte în rupturi de dimensiuni diferite în diferitele celule, reparate din nou fie prin telomerază, fie prin capturarea telomerilor.
În mod remarcabil, oricare ar fi mecanismul, a fost detectată o prevalență ridicată a cazurilor, în care ambele dezechilibre au aceeași origine parentală (Fig. 1, Resurse online 1: Tabelul S2), în ciuda faptului că o origine biparentală a deleției și a duplicării ar fi de așteptat în jumătate din cazuri, conform unui eveniment final postzigotic. Demonstrarea unei compartimentări distincte a celor două seturi de cromozomi parentali în embrionii de șoareci până în stadiul de 8 celule (Du et al. 2017) poate oferi o explicație. Având în vedere că această perioadă coincide cu o instabilitate cromozomială foarte ridicată, (McCoy et al. 2017), este tentant să speculăm că un mecanism precum captarea telomerilor, necesar pentru stabilizarea unei anomalii structurale anterioare, are loc pe același set cromozomial parental al anomaliei inițiale. În schimb, ar fi de așteptat ca alte reajustări ulterioare să aibă loc în mod aleatoriu, implicând cromozomi de ambele origini parentale, ceea ce ar duce la un cromozom translocat dezechilibrat de origine biparentală, așa cum am constatat într-adevăr în cinci cazuri (cazurile 10, 12, 27, 30 și 31; Fig. 1, Resursă online 1: Tabelul S2).
În ceea ce privește rearanjamentele de clasă C, nu am găsit nicio particularitate a punctelor de ruptură de joncțiune care ar putea clarifica dacă stabilizarea lor prin captarea telomerului porțiunii cromozomiale opuse celei ștearsă se datorează unui mecanism diferit față de cazurile în care captarea telomerului este dependentă de un alt cromozom. Cu toate acestea, această analiză a putut fi făcută doar în două cazuri. Constatarea faptului că în 4 din cele 5 cazuri atât deleția, cât și duplicarea au fost de origine paternă sugerează că acestea derivă fie dintr-o deleție originală, fie din ruperea unui cromozom dicentric.
Translocații și inversiuni complexe dezechilibrate (clasele B și D)
Există un acord general că aceste rearanjamente rezultă printr-un dicentric intermediar, după ruperea sa asimetrică care duce la o del inv-dup și un cromozom pur și simplu deletat (Fig. 1B.III). Dobândirea unei secvențe telomerice stabilizatoare poate avea loc printr-o serie de modalități: adăugarea de secvențe TTAGGGG de novo mediată de telomerază, capturarea telomerică a porțiunii distale a unui alt cromozom (Yu și Graf 2010) sau a porțiunii opuse a aceluiași cromozom (Buysse et al. 2009; Fan și Siu et al. 2001), sau chiar formarea unui cromozom inelar (Rossi et al. 2008). Cele două cazuri translocate inv-dup del(8p) del(8p) pe care le-am putut genotipa (cazurile 42 și 44) își au originea, așa cum era de așteptat (Giglio et al. 2001), în NAHR la mat-MI, după cum demonstrează prezența a două alele materne și a unei alele paterne în regiunea de duplicare 8p (Resursă online 1: Tabelul S2). Această recombinare anormală recurentă este mediată de duplicații segmentare foarte identice situate la 8p23 în cadrul unui cromozom 8 normal și al unui cromozom 8 inversat (Giglio et al. 2001). În zigot, cromozomul dicentric rezultat va suferi probabil diferite evenimente de rupere în diferite celule, ducând uneori la o stare mozaicată cu o linie celulară del(8p) și o a doua linie celulară cu inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010) sau, în cazuri excepționale, chiar o a treia linie celulară cu inv-dup del(8p) care se termină cu regiunea distală a unui alt cromozom (Pramparo 2004). Aceste mozaicuri sunt mai frecvent detectate în diagnosticul prenatal, în timp ce în viața postnatală o singură linie celulară cu inv-dup del(8p), translocată sau nu, este cea mai frecventă constatare, cel puțin în sânge. În cele trei cazuri translocate ale noastre (cazurile 42, 43 și 44), telomerii au fost donați de 6q, 17p și, respectiv, Xq, toate de origine maternă și cu același haplotip de dublare a cromozomilor materni 6, 17 și X, așa cum era de așteptat pentru un eveniment de stabilizare care a avut loc postzigotic. În celelalte trei cazuri (cazurile 39, 40 și 45), care, la fel ca toate rearanjamentele inv-dup del care nu implică 8p, nu sunt recurente, inv-dup translocat a fost de origine paternă, cu alele paterne identice în regiunea de dublare, în timp ce captarea telomerului a fost asigurată de un cromozom de origine paternă în două cazuri (cazurile 39 și 49, Resursă online 2: Figurile S3, S4) și unul matern în cel de-al treilea caz (cazul 45), un făt la care cromozomul translocat t(inv-dup5p;3q) era în mozaic cu o linie celulară care conținea un inv-dup del(5p) netranslocat (Resursă online 2: Figura S12). În mod notabil, duplicarea 5p are dimensiuni diferite în cele două linii celulare (Resursă online 1: Tabelul S1), arătând într-adevăr că cromozomul dicentric original este probabil prezent în zigot sau în embrionul foarte timpuriu (Fig. 1b), a suferit rupturi diferite în diferitele celule, dincolo de embrionul aflat în stadiul de clivaj.
Alelele identice duplicate au fost raportate de bună credință în toate rearanjamentele inv-dup del care nu implică 8p, indicând astfel o origine intracromosomală a acestor rearanjamente (Hermetz et al. 2014). În consecință, aceste rearanjamente inv-dup translocate par a fi rezultatul final al unui eveniment mitotic inițial, posibil în embrionul timpuriu (Voet 2011), cum ar fi o ruptură de catenă dublă urmată de împerechere intrastrandală în situsuri relativ apropiate de secvențe omologe inversate, ceea ce duce la generarea cromozomului dicentric cu o regiune de copie normală interpusă (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). După cum s-a menționat deja, produsul reciproc al inv-dup del, și anume, un cromozom șters, poate fi reparat și stabilizat prin capturarea porțiunii distale a unui cromozom neomolog sau a brațului opus al aceluiași cromozom, rezultând o simplă translocație sau inversiune dezechilibrată, așa cum propunem pentru unele dintre rearanjamentele enumerate în clasele A și C (Fig. 1b).
Joncțiuni de punct de ruptură
Secvențierea joncțiunii de translocație de punct de ruptură a putut fi realizată în 26 de cazuri (Resursă online 1: Tabelul S1, Resursă online 2: Figura S1), deși în 4 cazuri complexitatea criptică (cazurile 4, 10, 28 și 51) a împiedicat o secvențiere fină. În 16 cazuri (cazurile 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 și 52), au fost detectate caracteristici alternative de joncțiune finală neomologă (alt-NHEJ) sau de replicare indusă de ruperea mediată de microhomologii (MMBIR), cum ar fi microhomologii și inserții mici template sau netemplate (cazurile 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 și 52) (Resursă online 2: Figura S1). În mod remarcabil, deși în cazurile 18 și 40 rearanjarea a avut loc în cadrul secvențelor Alu, prezența unei inserții scurte de 5 pb template și, respectiv, a unei microhomologii de 4 pb, a arătat că rearanjarea nu a realizat un mecanism mediat de NAHR, ci mai degrabă un alt-NHEJ sau MMBIR. NHEJ canonic (c-NHEJ, joncțiuni cu capete contondente) a apărut în patru cazuri (cazurile 26, 29, 31 și 43). În cazurile 2 și 38, joncțiunile de punct de rupere, au fost la marginea retrotranspozonului omolog (Resursă online 2: Figura S13). Această constatare sugerează că, într-o minoritate de cazuri, mecanismele de reparare, cum ar fi capturarea telomerului, sunt facilitate de aceste secvențe. Deși Robberecht și colab. au constatat că majoritatea translocațiilor dezechilibrate de novo au fost mediate de NAHR între LINE-uri, HERV-uri sau duplicații segmentare (Robberecht și colab. 2013), putem exclude un eveniment NAHR cel puțin în cazul 2, în care prezența a două haplotipuri materne duplicate, unul translocat pe cromozomul receptor, indică în mod clar o non-disjuncție mat-MI (Fig. 1, Resursă online 1: Tabelul S2), făcând astfel imposibilă atribuirea translocației unui eveniment meiotic. Într-adevăr, s-a demonstrat că evenimentele de retrotranspunere mediată de LINE-1 au avut loc în celulele somatice ale embrionului uman timpuriu, în celulele stem embrionare umane și cel puțin la șoareci, în principal în embriogeneză (pentru o revizuire Kazazian și Moran 2017), susținând că, în cazurile noastre, formarea translocației a fost, de asemenea, un eveniment postzigotic.
Combinate, aceste caracteristici indică faptul că mecanismele bazate pe reparare (c-NHEJ și alt-NHEJ) și mecanismele de reparare replicativă (MMBIR) sunt responsabile pentru joncțiunea cromozomului donator cu cel receptor, sau cu porțiunea opusă a aceluiași cromozom (Fig. 1).
Relația genotip-fenotip
Deși corelațiile genotip-fenotip în rearanjamentele dezechilibrate mari, cum sunt cele raportate în studiul nostru, sunt în general destul de grosiere, datele pe care le raportăm adaugă unele detalii suplimentare și în acest context.
Dovezile puternice că unele translocații dezechilibrate provin dintr-un zigot cu un cromozom supranumerar care suferă un eveniment cromotipal, sugerează că regiunea de duplicare, deși aparent compusă doar din regiunea distală a cromozomului cromotipal, poate conține fragmente din alte porțiuni, așa cum este cazul cazului nostru 6 și așa cum au arătat Weckselblatt et al. (2015). În aceste cazuri, dacă dimensiunea fragmentelor fragmentate este sub cea detectabilă prin array CGH, riscul este de a atribui fenotipul anormal doar genelor care par duplicate sau deletate, în timp ce morbiditatea ulterioară se poate datora expresiei anormale a genelor generate de întreruperea TAD (Fukami et al. 2017).
În plus, în cazul translocațiilor dezechilibrate care provin din salvarea trisomiei parțiale, dacă cromotripsisul ar avea loc pe cromozomul supranumerar de origine paternă, următoarea hetero/izodisomie maternă pentru cei doi cromozomi rămași ar putea genera patogenitate suplimentară (Niida et al. 2018), fie prin reducerea la starea homozigotă a variantelor cauzatoare de boală prezente la mamă în stare heterozigotă, fie datorită prezenței unor gene imprimate care sunt exprimate doar de alela paternă.
Ca o considerație finală, este tentant să speculăm că alegerea telomerului care este capturat pentru stabilizarea cromozomului rupt, ar putea să nu fie aleatorie, ci influențată de dereglarea TAD-urilor originale (Topologically Associated Domains), creând la rândul său un substrat favorabil pentru contacte intercromosomale specifice și compartimentare spațială a cromatinei 3D (Dekker și Mirny et al. 2016).
.