PARADIGME ALE ROLULUI INTERACȚIUNILOR CD40-CD40L ÎN BOALĂ

Transplant. Chirurgia de transplant nu ar fi atins gradul de succes înregistrat în ultimele decenii fără dezvoltarea unor agenți imunosupresori eficienți care să minimizeze riscul de respingere a transplantului. Anticorpul monoclonal (MAb) împotriva CD40L a fost utilizat ca tratament imunosupresor în multe modele de transplant la animale. La primate, administrarea de MAb anti-CD40L întârzie respingerea alogrefei de transplant, în timp ce asocierea cu CTLA4Ig, o proteină chimerică formată din domeniul extracelular al moleculei de suprafață celulară CTLA-4 și regiunea Fc a IgG1 umane care blochează calea CD28-B7, are efecte aditive și sinergice. Acest tratament combinat susține supraviețuirea alogrefei de rinichi la primate și crește supraviețuirea grefei de piele la șoareci (53, 69). Trecerea la tratamentul cu MAb anti-CD40L, după 60 de zile de imunosupresie convențională cu CsA, a fost un tratament eficient într-un model de alogrefă renală la maimuțe, chiar dacă se știe că CsA reduce expresia CD40L pe celulele T (7). S-a demonstrat că expresia genei CD40L crește de patru ori în cazurile de respingere acută. Aceasta ar putea servi ca metodă neinvazivă de monitorizare a funcției alogrefei și, de asemenea, de determinare a răspunsului biologic la agenții imunosupresori clasici, cum ar fi CsA și tacrolimus, ambele cunoscute ca inhibând inducerea CD40L (54). În modelele de transplant la animale, inhibitorii de calcineurină suprimă expresia CD40L pe celulele T in vitro, dar nu și în țesutul limfoid, ceea ce indică faptul că calea CD40-CD40L rămâne funcțională în timpul tratamentului cu acești agenți, ceea ce poate contribui la respingerea alogrefei în context clinic (63).

Ateroscleroză. Viziunea actuală asupra aterosclerozei, cea mai răspândită boală mortală din lumea occidentală, este aceea a unei boli cronice, degenerative, inflamatorii, în care se crede că sistemul imunitar joacă un rol important. CD40 și CD40L sunt supraexprimate în leziunile aterosclerotice experimentale și umane. Ligatura CD40 pe tipurile de celule asociate ateromului, cum ar fi celulele endoteliale, celulele musculare netede și macrofagele, duce la o expresie crescută a mediatorilor pentru dezvoltarea aterosclerozei, cum ar fi citokine, chemokine, factori de creștere și metaloproteinaze. Blocarea interacțiunilor CD40-CD40L cu MAb anti-CD40L la șoareci are ca rezultat diminuarea formării și progresiei ateromului la șoareci, dar favorizează și astfel de modificări în biologia și structura leziunii, care pot fi importante în stabilizarea plăcii în boala umană (52).

Plachetele exprimă, de asemenea, CD40L și se crede că acestea contribuie semnificativ la recrutarea celulelor inflamatorii la endoteliul deteriorat in vivo (5). Celulele T activate care exprimă CD40L sunt localizate în peretele vaselor aterosclerotice, fapt care susține ipoteza că celulele T CD4+ activate pot orchestra procesul aterosclerotic (43).

Alte boli în care perechea CD40-CD40L poate juca un rol sunt prezentate pe scurt în tabelul 1. O scurtă discuție a rolului acestei interacțiuni în bolile autoimune lupus eritematos sistemic (LES), poliartrită reumatoidă (AR) și polimiozită urmează mai jos.

SLE. (i) Expresia CD40L în LES uman (tabelul 2). Desai-Mehta et al. au raportat că celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) de la pacienții cu lupus activ prezintă o creștere de 21 de ori a procentului de celule CD40L+ CD4+ în comparație cu subiecții sănătoși. La stimularea suplimentară a PBMC cu MAb anti-CD3, procentul de celule CD40L+ CD4+ a crescut de cinci ori la subiecții sănătoși, dar doar de 1,4 ori la pacienții cu LES activ. Cu toate acestea, procentul de celule T CD40L+ a rămas totuși mai mare în grupul cu LES activ. PBMC de la pacienții cu LES în remisiune s-au comportat într-un mod similar cu cel al grupului de control. Observații similare au fost făcute în ceea ce privește expresia CD40L de către celulele T CD8+ proaspăt izolate de la pacienții cu LES activ (expresie de 22 de ori mai mare decât în cazul grupului de control). Celulele B supraexprimă CD40L la pacienții cu LES activ la niveluri comparabile cu cele observate la celulele T activate. Celulele B umane normale exprimă niveluri foarte scăzute de CD40L și numai atunci când sunt manipulate, spre deosebire de celulele B active-SLE care exprimă CD40L în mod spontan (12).

Într-un studiu publicat de Koshy et al., PBMC activate de la subiecți sănătoși sau pacienți care controlează boala au prezentat o expresie de mare intensitate a CD40L cu o scădere treptată până aproape de valorile inițiale la 48 h, în timp ce PBMC cu lupus au continuat să demonstreze niveluri semnificativ mai mari de CD40L la acest moment. În acest studiu nu s-a constatat nicio corelație aparentă a expresiei CD40L cu activitatea bolii (33).

Higuchi et al. au confirmat aceste rezultate atât în LES, cât și în lupusul murin, sugerând că expresia CD40L ectopică în celulele B lupice poate juca un rol crucial în dezvoltarea LES. Șoarecii transgenici predispuși la lupus, care exprimă CD40L pe celulele B, produc în mod spontan autoanticorpi și, în plus, jumătate dintre acești șoareci dezvoltă glomerulonefrită cu depunere de complexe imune (22). Devi et al. au confirmat, de asemenea, expresia ridicată a CD40L pe celulele T și B ale lupusului. Mai precis, 45 % din celulele T de la pacienții cu LES exprimă CD40L, comparativ cu numai 8 până la 18 % din celulele T de la subiecți sănătoși sau de la pacienții cu AR. Mai mult, 30% din cei 48 de pacienți cu LES examinați prezentau o expresie crescută a CD40L și pe celulele B (13). Cu toate acestea, în contrast cu rezultatele de mai sus, există un raport în care nu s-au constatat modificări ale expresiei CD40L în limfocitele lupice. În schimb, acești autori au raportat o expresie ridicată a CD86 pe celulele B din LES, care este, de asemenea, o moleculă costimulatoare importantă (3). Un alt studiu a raportat că monocitele de la pacienții cu LES activ exprimă în mod aberant CD40L. Douăzeci și trei de pacienți cu LES activ au fost studiați și comparați cu 16 persoane sănătoase. Rezultatele au arătat o creștere de șapte ori a frecvenței monocitelor periferice care exprimă CD40L de la pacienții cu LES în comparație cu subiecții sănătoși. Expresia CD40L a fost verificată atât la nivel de ARNm, cât și la nivel proteic și s-a corelat semnificativ cu activitatea bolii (28).

CD40L este scindat de pe suprafața celulară a celulelor T activate, de către o metaloproteinază de matrice, eliberând sCD40L, o moleculă de aproximativ 18 până la 20 kDa, care formează homotrimere. Un raport care studiază rolul funcțional al sCD40L a concluzionat că sCD40L poate induce activarea și diferențierea celulelor B. Nivelurile plasmatice de sCD40L au fost semnificativ mai ridicate la pacienții cu LES activ decât la donatorii sănătoși. Aceste niveluri s-au corelat cu activitatea bolii, evaluată prin SLEDAI, și cu titlurile de autoanticorpi anti-ADN bicatenar (ADN dublu catenar) circulant. S-a emis ipoteza că nivelurile ridicate de sCD40L găsite la pacienții cu LES activ ar putea juca un rol patogenic în vasculită și în nefrita care apare în lupusul activ. Autorii au propus că nivelurile de sCD40L ar putea servi în viitor ca marker predictiv al crizelor de boală din LES (27). Vakkalanka et al. au arătat, de asemenea, concentrații medii semnificativ mai mari de sCD40L la pacienții cu lupus decât la controalele bolii și la subiecții sănătoși. Mai exact, 66 de pacienți cu LES au fost studiați și comparați cu 30 de pacienți de control al bolii și 23 de persoane sănătoase. La subiecții sănătoși, sCD40L a fost aproape nedetectabilă, în timp ce 38 de pacienți cu LES au avut un nivel de sCD40L de peste 2 ng/ml (cu o concentrație medie de 2,61 ± 2,15 ng/ml) și numai 7 pacienți de control al bolii au avut un nivel de sCD40l de peste 1 ng/ml. Pacienții au fost împărțiți în trei grupe, severă, moderată și ușoară, în funcție de manifestările clinice. Pacienții cu LES sever au avut o concentrație medie de sCD40L de 3,93 ± 2,86 ng/ml, cei cu LES moderat au avut o concentrație medie de sCD40L de 2,81 ± 1,57 ng/ml și, în cele din urmă, cei cu boală ușoară au avut o concentrație medie de sCD40L de 1,52 ± 1.06 ng/ml, ceea ce indică o corelație între nivelul sCD40L și activitatea bolii (62).

În timp ce inducerea CD40L pe celulele T normale activate este inhibată în prezența CsA, este interesant faptul că acest efect nu se aplică celulelor T din LES. Un studiu privind expresia CD40L în lupusul uman a concluzionat că CsA nu a reușit să inhibe expresia CD40L prelungită și îmbunătățită, observată in vitro pe celulele T lupice activate cu anti-CD3 MAb. Rezistența la CsA a fost independentă de activitatea bolii. Monocitele lupice circulante prezintă, de asemenea, o rezistență proeminentă la efectele inhibitoare ale CsA asupra expresiei CD40L. Aceste rezultate indică faptul că inducerea CD40L pe celulele T din LES poate fi reglată de o cale independentă de calciu/calcineurină (29).

Nu este clar de ce expresia CD40L este mai mare la pacienții cu LES și dacă această supraexpresie are implicații patogenetice. S-a propus că limfocitele T din LES, atunci când sunt activate prin angajarea TCR, favorizează un profil NFAT-dominant în locul unui profil echilibrat al factorului de transcripție NFAT-AP-1. Acest panou de mediatori intracelulari promovează transcrierea și stabilitatea ARNm a anumitor gene, inclusiv a genei CD40L. Expresia timpurie a CD40L în celulele T din LES necesită calea NFAT sensibilă la CsA, dar expresia prelungită depinde mai mult de o kinază MAP specifică, și anume kinaza reglată prin semnal extracelular. Activitatea crescută și persistentă a kinazei reglată de semnalul extracelular în celulele T din lupus ar putea contribui la supraexprimarea CD40L prin activarea factorului de transcripție AP-1 și, posibil, prin stabilizarea ARNm CD40L (10, 68). Fluxurile citoplasmatice de Ca2+ sunt supranormale în celulele T și B circulante de la pacienții cu LES și s-a propus ca această anomalie să reprezinte fundalul molecular pentru expresia anormală a CD40L în lupus (38, 40, 64). Există, de asemenea, dovezi că deficiența lanțului TCR ζ, care a fost descrisă la pacienții cu LES, poate fi parțial responsabilă pentru răspunsul supranormal la Ca2+ menționat mai sus (39, 61). Această corelație a fost întărită de raportul recent conform căruia corecția prin transfecție a deficienței lanțului TCR ζ în celulele T din lupus duce la normalizarea fluxurilor citoplasmatice de Ca2+ (48).

(ii) Utilizarea MAb anti-CD40L în modelele de lupus și în LES. Funcțiile multiple ale CD40/CD40L în răspunsul imunitar au făcut din acesta o țintă atractivă pentru intervenția terapeutică în bolile autoimune. MAb-urile împotriva CD40L au fost testate inițial pe modele de lupus murin. Tratamentul șoarecilor New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) F1 cu perfuzii continue de MAb anti-CD40L a dus la întârzierea debutului bolii cu o medie de 4 luni, la o scădere a nivelurilor de autoanticorpi IgG anti-dsDNA, la o întârziere a acumulării de celule T cu fenotip de memorie activat, la o scădere a numărului de celule B în splină și la o suprimare a schimbării clasei de Ig și a mutațiilor somatice. Nivelurile serice ale anticorpilor IgG anti-dsDNA au fost de 4 până la 10 ori mai mici decât la martorii netratați, potriviți ca vârstă. La încetarea tratamentului, fenotipul celulelor T ale șoarecilor tratați a devenit imposibil de distins de cel al martorilor, iar celulele B au atins un fenotip complet activat, cu creșterea titlurilor de IgG anti-dsDNA și dezvoltarea proteinuriei și a bolii renale progresive (65).

Un alt studiu a utilizat tratamentul combinat cu anticorp anti-CD40L și CTLA4Ig. Tratamentul combinat pe termen scurt al șoarecilor prenefritici NZB×NZW F1 a dus la o apariție întârziată a disfuncției renale timp de aproximativ 6 luni. După apariția proteinuriei, un tratament repetat a fost capabil să inducă o remisiune la șoarecii tratați anterior, dar nu și la șoarecii netratați anterior. S-a înregistrat o scădere a nivelului de autoanticorpi IgG anti-dsDNA, iar splina murină a fost marcant epuizată de celule B, chiar și la 16-20 de săptămâni după perfuzie. S-a emis ipoteza că tratamentul cu CTLA4Ig și cu MAb anti-CD40L poate acționa sinergic pentru a bloca semnalele antiapoptotice și, prin urmare, pentru a facilita apoptoza celulelor B în timpul activării timpurii a celulelor B. Acest tratament nu a provocat imunosupresie globală pe termen lung (66).

Rezultatele promițătoare obținute în studiile experimentale pe animale nu au fost confirmate în LES. În lupusul uman, ciclofosfamida rămâne „standardul de aur ” pentru tratamentul afectării organelor majore. Ciclofosfamida este un agent alchilant care determină o inhibiție nespecifică a răspunsului imunitar și o imunosupresie semnificativă din punct de vedere clinic. Aceasta are efecte secundare semnificative, inclusiv cancerul de vezică urinară și insuficiența gonadică, ceea ce face ca nevoia de noi intervenții terapeutice să devină o necesitate. Administrarea de ciclofosfamidă a fost un tratament consacrat pentru nefrita lupică, o complicație frecventă și de temut a LES și una dintre principalele cauze de morbiditate și mortalitate.

Au fost publicate două studii privind administrarea de MAb anti-CD40L în lupusul uman. În primul, un studiu de fază 2, dublu-orb, controlat cu placebo, multicentric, au fost înrolați 85 de pacienți cu LES ușor până la moderat activ și au primit 6 injecții de IDEC-1 (MAb anti-CD40L) sau placebo pe parcursul a 16 săptămâni. Eficacitatea a fost evaluată la săptămâna 20, în principal prin utilizarea SLEDAI. Rezultatele au arătat că tratamentul cu IDEC-1 a fost sigur și bine tolerat, dar nu a reușit să demonstreze eficacitate în comparație cu placebo (19, 26).

Cel de-al doilea studiu a evaluat pacienții cu nefrită lupică proliferativă dovedită prin biopsie, utilizând BG9588 (anti-CD40L MAb). Au fost înrolați 28 de pacienți cu nefrită lupică proliferativă activă și au primit 20 mg de BG9588/kg de greutate corporală la intervale bisăptămânale pentru primele trei doze și la intervale lunare pentru patru doze suplimentare. Rezultatele au arătat o reducere cu 50% a proteinuriei (acolo unde era prezentă) fără înrăutățirea funcției renale, dispariția hematuriei și o creștere a concentrației serice de C3. Titrul de autoanticorpi anti-ADNdS a scăzut după tratament, cu reduceri medii de 38,8, 50,1 și 25,3% la 1, 2 și, respectiv, 3 luni după tratament (4). Acest studiu a fost întrerupt prematur din cauza complicațiilor tromboembolice. Mai exact, au fost raportate două cazuri de infarct miocardic. Efectele trombotice care au complicat acest regim de tratament au ridicat probleme importante în ceea ce privește viitoarele studii cu oameni. Trebuie remarcat faptul că niciunul dintre pacienții care au suferit un eveniment trombotic nu avea anticorpi antifosfolipidici demonstrabili. Rolul interacțiunii CD40-CD40L în aceste complicații trombotice rămâne neclar și ipotetic.

Un studiu efectuat pe 5 pacienți cu nefrită lupică care au primit tratament anti-CD40L a arătat că o scurtă cură de acest tratament duce la o reducere a numărului de celule B producătoare de anticorpi IgG anti-DNA. Aceste modificări au persistat timp de câteva luni după încetarea tratamentului (25). Un studiu similar efectuat pe patru pacienți cu nefrită lupică activă care au primit tratament cu anti-CD40L (BG9588) a arătat că celulele B care exprimă CD38, CD5 și CD27, care sunt considerați markeri de diferențiere a celulelor B, au dispărut de la periferie în timpul tratamentului cu anti-CD40L. Aceste modificări au fost asociate cu o scădere a nivelurilor anticorpilor anti-dsDNA, a proteinuriei și a indicelui de activitate a bolii LES (20).

RA. (i) Expresia CD40L în AR (tabelul 2). AR este o boală reumatismală sistemică autoimună frecventă, caracterizată printr-un proces distructiv tisular cronic atribuit unui posibil răspuns imunitar în curs de desfășurare determinat de antigen. Deoarece se consideră că celulele T activate joacă un rol cheie, nu este surprinzător faptul că interacțiunile CD40-CD40L au fost studiate în contextul AR.

Berner și colab. au studiat expresia CD40L pe celulele T de la pacienții cu AR. Au fost studiați șaizeci și doi de pacienți cu PR și 20 de subiecți sănătoși. CD40L a fost puternic exprimat pe >10% din celulele T la 29% dintre pacienții cu RA, dar pe 0% din celulele T la martorii sănătoși. Pacienții cu RA cu >10% de celule T CD4+ CD40L+ au avut o boală mai activă. Optzeci și trei la sută dintre pacienții din acest grup prezentau niveluri crescute ale proteinei C reactive, 89% dintre ei erau pozitivi la factorul reumatoid (RF) și niciunul dintre ei nu îndeplinea criteriile Colegiului American de Reumatologie pentru remisiune clinică completă, sugerând o corelație puternică între activitatea bolii și expresia CD40L (2). Expresia CD40L la niveluri ridicate poate reflecta o activare crescută și prelungită a limfocitelor, ceea ce duce la o activitate inflamatorie crescută și prelungită. Expresia CD40L funcțională la niveluri ridicate pe celulele T de la pacienții cu PR a fost, de asemenea, demonstrată de MacDonald și colab. (42).

Un alt studiu a abordat rolul semnalizării CD40-CD40L în producția de FR. În sistemul imunitar sănătos, celulele B autoreactive de înaltă afinitate sunt eliminate. La persoanele sănătoase, în ganglionii limfatici există celule B producătoare de RF de joasă afinitate, dar RF de înaltă afinitate este nedetectabil. În AR, celulele B producătoare de RF de înaltă afinitate se acumulează în sinovia inflamată. Rezultatele acestui studiu au indicat că interacțiunea dintre CD40L de pe celulele T activate și CD40 de pe celulele B producătoare de RF este crucială, nu numai pentru supraviețuirea acestor celule B autoreactive, ci și pentru sinteza RF. S-a constatat că cele două semnale necesare și suficiente pentru inducerea sintezei RF de înaltă afinitate in vivo sunt IgG și interacțiunea CD40-CD40L. În absența interacțiunii CD40-CD40L, celulele B RF au fost eliminate (35).

Cho et al. au studiat rolul interacțiunii CD40-CD40L în producerea factorului de creștere a endoteliului vascular (VEGF). În AR, sinovia inflamată are caracteristici asemănătoare unei tumori. Perpetuarea și expansiunea panusului reumatoid depind de neovascularizare, deoarece migrarea extensivă a celulelor mononucleare în sinovia și creșterea excesivă a panusului depind de existența unui pat vascular bogat. VEGF, o glicoproteină dimerică care se leagă de heparină, este un mediator central al angiogenezei și induce proliferarea celulelor endoteliale și permeabilitatea capilară. S-a demonstrat că ligatura CD40 pe fibroblastele sinoviale de către CD40L pe celulele T activate a dus la o producție crescută de VEGF, care este amplificată și mai mult în prezența IL-1, TNF-α și a factorului de creștere transformator β (8). Ligatura CD40 pe sinoviocitele RA de către CD40L pe celulele T activate din sinovia crește semnificativ producția de TNF-α într-un mod dependent de doză (21). TNF-α este o citokină cheie în patogeneza RA. Pe lângă TNF-α, producția de IL-10 este, de asemenea, crescută prin intermediul interacțiunilor CD40-CD40L (15). Celulele T din lichidul sinovial de la pacienții cu PR exprimă niveluri ridicate de CD40L în comparație cu celulele T din sângele periferic al donatorilor sănătoși, iar după activarea in vitro, acestea prezintă o expresie prelungită, la nivel ridicat, a CD40L. Rezultatele au arătat că 8,71% din celulele T din lichidul sinovial de la pacienții cu PR sunt CD40L+ față de 1,74% în grupul de control (41). Rolul potențial al interacțiunii CD40-CD40L în patogeneza PR a condus la eforturi de manipulare farmacologică a acestei axe ca abordare terapeutică la pacienții cu PR.

(ii) Utilizarea MAb anti-CD40L în modelele animale de PR. Tratamentul cu anti-CD40L MAb suprimă dezvoltarea artritei induse de colagen, care este un model animal de PR. Mai precis, dezvoltarea inflamației articulare a fost blocată, iar infiltrarea cu celule inflamatorii a țesutului subsinovial și eroziunea cartilajului au fost diminuate (14). La șoarecii transgenici K/B×N, un model de artrită mediată de Ig, tratamentul cu MAb anti-CD40L a diminuat semnificativ dezvoltarea artritei atunci când a fost administrat cu o săptămână înainte de debutul bolii clinic evidente, dar tratamentul nu a avut succes atunci când a fost administrat în cazul bolii stabilite (36).

Dermatomiozită/polimiozită. Într-un studiu care a analizat 9 pacienți cu polimiozită și dermatomiozită, s-a observat că celulele T care infiltrează mușchii erau CD40L+ în toate cele 9 cazuri, sugerând un rol potențial al interacțiunilor CD40-CD40L în entitățile clinice de mai sus (58).

.