DR. EDWIN B. ASTWOOD a fost un vizionar al endocrinologiei moderne. Memoriul biografic al lui Roy Greep și Monte Greer se încheia astfel: „Pe lângă contribuțiile sale specifice în domeniul cercetării, Dr. Edwin B. Astwood a reușit într-o măsură pe care puțini au reușit să o atingă în a acoperi aria largă dintre științele naturale și medicina clinică”. Pentru mine, aceasta este cea mai înaltă vocație în endocrinologie.

Sfârșitul anilor 1960 și începutul anilor 1970 au fost marcați de realizările incredibile a două grupuri, cele ale doctorilor Andrew Schally și Roger Guillemin, care au izolat, caracterizat și secvențiat hormonii reglatori hipotalamici. Primul hormon reglator hipotalamic care a fost secvențiat a fost TRH (o tripeptidă), al doilea a fost hormonul de eliberare a gonadotropinei (o decapeptidă), iar al treilea a fost somatostatina cu 14 aminoacizi. Existența GHRH fusese sugerată la începutul anilor 1960 de unele experimente clasice ale lui Reichlin (1); acesta a făcut leziuni în hipotalamus și a demonstrat că conținutul de GH din hipofiză a scăzut. Pe baza acestor date, el a sugerat că trebuie să existe un GHRH în hipotalamus.

Am făcut pregătirea mea medicală la Londra, în Anglia, cu pregătire endocrină sub conducerea profesorului G. Michael Besser. Una dintre cele mai plăcute conferințe la care am participat în mod regulat a fost prezentarea de cazuri clinice la Royal Society of Medicine. Mi-a rămas întipărit în minte faptul că, de fiecare dată când era prezentat un pacient cu acromegalie, profesorul Peter Sonksen întreba dacă pacientul avea sau nu semne de tumoră carcinoidă. Percepția în audiență era „De ce acest om pune mereu această întrebare?”, deoarece astfel de cazuri probabil că nu există sau, dacă există, foarte rar!

În 1977, m-am mutat de la Spitalul St. Bartholomew’s (Londra, Anglia) la Universitatea din Virginia. Principalul meu interes la acea vreme erau tumorile hipofizare care secretă PRL și tratamentul medical al acestora.

În octombrie 1980, un pacient în vârstă de 21 de ani mi-a fost recomandat de Dr. Ann Johanson. Această pacientă avea amenoree și galactorree în timp ce lua un contraceptiv oral pentru înlocuirea steroizilor gonadici. Avea agenezie gonadică din cauza sindromului Turner.

Evaluarea ei a evidențiat o fosa hipofizară mărită la radiografia craniană, o masă hipofizară cu o extensie supraselară modestă la tomografia computerizată și o PRL serică ridicată de 68 μg/L. GH seric ridicat de 95 μg/L nu a fost suprimat cu glucoză orală, a crescut cu TRH și a fost suprimat cu o perfuzie de dopamină. Nivelul seric al factorului de creștere asemănător insulinei (IGF)-I a fost ridicat la 11 U/mL (normal, 0,41-2,2 U/mL).

Pe baza acestor rezultate, diagnosticul de acromegalie a fost clar. Este interesant faptul că înălțimea pacientei era de 1,75 m, ceea ce este foarte înalt pentru o pacientă cu sindromul Turner. În această privință, a fost un noroc că au fost salvate serurile din ultimii 7 ani. Concentrațiile sale serice de GH au fost ridicate în toată această perioadă de timp (Tabelul 1).

Pacienta a fost trimisă pentru o intervenție chirurgicală transsfenoidală, care a fost efectuată la 15 ianuarie 1981. Șapte săptămâni după operație, s-a demonstrat că încă avea acromegalie; GH seric era de 52 μg/L, iar IGF-I era încă ridicat la 7,7 U/mL.

Ca parte a unei colaborări în curs de desfășurare, probele de patologie hipofizară fuseseră trimise la Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Canada). Ceva mai târziu, Dr. Kovacs m-a sunat pentru a-mi comunica rezultatele examinării țesutului. Raportul său indica faptul că acest pacient avea hiperplazie somatotrofă și nu o tumoare hipofizară. Motivele care au condus la acest diagnostic au fost: 1) modelul reticulinei era păstrat (acesta este distrus în tumori) (Fig. 1); 2) predominau somatotrofele, deși erau intercalate tirotrofe, gonadotrofe și corticotrofe; și 3) microscopia electronică a somatotrofelor a evidențiat reticulul endoplasmatic bine dezvoltat și aparatul Golgi, ceea ce sugera o sinteză hormonală activă (Fig. 2). Deoarece somatotrofele erau dens împachetate cu granule secretorii, acest lucru mi-a sugerat că acest lucru reflecta inhibarea eliberării de hormoni din cauza feedback-ului GH secretat, probabil prin creșterea secreției de somatostatină (și/sau IGF-I).

Pe baza histologiei hipofizare, era clar că hipofiza era stimulată de un factor extrinsec. Era puțin probabil ca acest lucru să se datoreze unei mutații în receptorul GHRH sau unei activări constitutive a proteinei G cuplată la receptorul GHRH, deoarece acest lucru ar fi avut loc probabil într-o singură celulă, ceea ce ar fi dus la dezvoltarea tumorii și la descompunerea modelului de reticulină. Prin urmare, era mult mai probabil ca hipofiza să fie stimulată de un factor extrinsec, fie GHRH provenind din hipotalamus, fie de la periferie. În al doilea rând, acromegalia persistentă a făcut imperios necesar să găsim cauza acromegaliei acestui pacient. În acest moment, un articol al lui Frohman și colab. (2) a raportat purificarea parțială și caracterizarea unei peptide cu activitate de eliberare a GH din tumori extrapituitare de la pacienți acromegali.

O tomografie computerizată abdominală a demonstrat o tumoare cu diametrul de 5 cm în coada pancreasului. La 26 august 1981, tumora a fost extirpată. A fost bine încapsulată și la histologie s-a stabilit că este o tumoră cu celule insulare. Cu toate acestea, tumora nu era nici o tumoare cu celule β, nici una cu celule α. Era puternic pozitivă pentru enolază neuron-specifică, iar la imunocolorare era negativă pentru GH, insulină, glucagon, calcitonină și ACTH, cu o colorare echivocă pentru somatostatină.

Tumoarea nu conținea GH prin imunocitochimie. În primele 2 h de la extirparea tumorii a avut loc o scădere rapidă a nivelurilor serice de GH de la 70 μg/L la 3 μg/L (Fig. 3) (3). Pacienta a fost urmărită acum timp de 18 ani și a rămas vindecată de acromegalie.

Întrebarea următoare a fost ce să facem cu tumora pancreatică. La acea vreme am avut norocul de a-l avea ca și coleg la Universitatea din Virginia pe regretatul Dr. Michael Cronin. Michael a venit cu mine în sala de operație pentru a mă ajuta să punem în aplicare strategia noastră atent elaborată pentru tratarea tumorii. Jumătate din tumoră a fost tăiată în cuburi și pusă imediat în azot lichid, iar cealaltă jumătate a fost pregătită pentru cultura de țesuturi. Aceasta din urmă a fost trimisă la mai multe grupuri care erau experți în stabilirea unor linii celulare stabile. Michael Cronin a reușit să demonstreze că mediul care scălda această tumoare conținea activitate GHRH și stimula adenilatciclaza (4). Tumora a fost furnizată inițial doctorului Wylie Vale de la Institutul Salk (La Jolla, California), iar acesta i-a dat ulterior o parte din ea doctorului Guillemin. Cele două grupuri au constatat în mod independent că aceasta conținea o activitate GHRH ridicată și au reușit să izoleze GHRH din tumoră, să o caracterizeze și să o secvențieze (5-8). GHRH din această tumoră era o peptidă de 40 de aminoacizi, care are omologie cu membrii familiei de peptide glucagon/secretina/VIP.

Am ales endocrinologia ca specialitate pentru că mentorii mei mi-au imprimat importanța aplicării fiziologiei pentru înțelegerea fiziopatologiei și a terapiei pacienților cu boli endocrine.

Care pacient pe care îl vezi este un experiment al naturii. Am fost foarte norocos să mi se trimită acest pacient care ne-a permis mie și colegilor mei să furnizăm tumora la două grupuri de vârf care au putut apoi să izoleze, să caracterizeze și să secvențieze GHRH-ul mult căutat. De fapt, GHRH a fost unul dintre primii hormoni hipotalamici care au fost căutați, dar au existat multe începuturi false.

Au existat mai multe motive pentru care a fost posibil ca în 1982 să se caracterizeze și să se secvențieze cu succes GHRH. În primul rând, metodele de evaluare a activității extractelor tumorale fuseseră rafinate și erau mult mai sensibile. În al doilea rând, metodele de microsecvențiere au fost mult îmbunătățite în ultimii 10 ani. Dar al treilea motiv, și probabil cel mai important, a fost faptul că această tumoare conținea concentrații mari de GHRH și foarte puțină somatostatină. Somatostatina inhibă eliberarea de GH în testul biologic, astfel că prezența sa a încurcat monitorizarea purificării GHRH. Extractul din această tumoare a simplificat foarte mult procesul (deoarece conținea concentrații ridicate de GHRH și era prezentă puțină somatostatină), în comparație cu încercările anterioare care foloseau sute de mii de hipotalamii de animale care erau bogate în somatostatină și aveau concentrații foarte mici de GHRH. Acesta a fost primul exemplu de utilizare a unei singure tumori umane pentru identificarea și izolarea unui hormon. Proteina legată de PTH a fost izolată cu o tehnică similară folosind o linie celulară tumorală umană.

În calitate de clinicieni, avem cu toții responsabilitatea de a identifica experimentele naturii și de a profita de oportunitățile de a pune întrebări la care ar fi foarte greu de răspuns în orice alt mod. Experimentele naturii sunt adesea unice și, cu siguranță, cei 15 sau 20 de pacienți care au precedat-o pe aceasta au oferit indicii că o tumoare de la un pacient cu secreție ectopică de GHRH ar putea răspunde la întrebarea privind natura și structura GHRH. De fapt, grupul Dr. Guillemin a luat ulterior cunoștință de o altă tumoră de la Dr. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Franța) și, întrucât aveau mai mult țesut de la acea tumoră, au studiat-o mai agresiv decât pe cea din Charlottesville. Cu toate acestea, tumora originală din Charlottesville a fost cea care a sugerat că o astfel de tumoare ar putea oferi cheia pentru căutarea GHRH.

Studiul ulterior al fiziologiei GHRH și al potențialului său terapeutic ca tratament pentru deficitul de GH la copii a fost punctul central al activității grupului nostru în ultimii 17 ani (9, 10). Inițial, am administrat GHRH la voluntari normali și am demonstrat eficacitatea și specificitatea sa în creșterea concentrațiilor serice de GH (11). Apoi am determinat răspunsul GH la o injecție acută de GHRH la copiii cu deficit idiopatic de GH (Fig. 4). Mulți dintre copii au avut o creștere foarte puternică a GH, în timp ce la unii dintre ei s-a înregistrat o creștere mică sau deloc (12); răspunsul la GHRH a fost mai mare decât la arginină și l-dopa. Pe baza acestor rezultate, am propus că mulți copii cu deficit idiopatic de GH suferă de fapt de deficit de GHRH.

Apoi a fost inițiat un studiu multicentric de tratament cu GHRH. Acest lucru a părut deosebit de adecvat deoarece GH folosit pentru a trata deficitul de GH era derivat din cadavre și fusese implicat în transmiterea bolii Jacob Creutzfeld. Au fost tratați în total 24 de copii; la 10 copii s-a folosit o pompă pentru a administra un bolus de GHRH sc la fiecare 3 h. Această cale și doză au fost alese pentru a imita fiziologia normală de aproximativ un puls de GH la fiecare 3 h la copiii în creștere. În plus, 10 copii au fost tratați cu pompa la fiecare 3 h doar peste noapte, iar 4 copii au primit de două ori pe zi injecții sc de GHRH. Vitezele de creștere la copii înainte și la 6 luni de tratament sunt prezentate în Fig. 5 (13).

Pe baza rezultatelor acestui studiu, Serono Laboratories, Inc. a inițiat un studiu multicentric de 12 luni cu GHRH(1-29)-NH2 administrat sc o dată pe zi (14). Copiii care creșteau cel mai lent au avut cea mai mare creștere a vitezei de creștere (Fig. 6). Acest lucru sugerează că GHRH poate restabili secreția fiziologică de GH. GHRH este aprobată de Food and Drug Administration pentru utilizare diagnostică, precum și pentru tratamentul deficitului de GH la copii. GHRH este sigură și accelerează în mod eficient viteza de creștere la majoritatea pacienților cu deficit de GH.

În momentul în care GHRH a fost sintetizată, exista un mare interes pentru reducerea răspunsului gonadotropinei la hormonul eliberator de gonadotropină. Am fost intrigați de o observație la un alt pacient cu secreție ectopică de GHRH de la o tumoare carcinoidă metastatică care a dat naștere la acromegalie. În ciuda nivelurilor crescute persistente de GHRH de-a lungul perioadei de 24 de ore, modelul de eliberare a GH a fost încă pulsatil, ceea ce indică faptul că există probabil și alți factori care sunt implicați în reglarea modelului pulsatil al secreției de GH (15). S-a sugerat că acest lucru se poate datora retragerii somatostatinei. Astfel, secreția ectopică de GHRH demonstrează fără echivoc faptul că un agonist GHRH cu durată lungă de acțiune poate crește secreția pulsatilă de GH. Studiile de perfuzie iv continuă de GHRH la subiecți normali demonstrează același fenomen și, astfel, este clar că un preparat de depozit de GHRH poate fi un agent terapeutic util.

Grupul nostru (16) și Mayo (17) au clonat receptorul GHRH. Este interesant faptul că receptorul GHRH este un membru al clasei B de receptori cuplați cu proteina G, care include receptorii pentru familia de peptide glucagon/secretină, precum și CRH, calcitonina și hormonul paratiroidian. Structura lor este total diferită de cea a receptorilor mai mari ai rodopsinei (familia A) de receptori. Cu toate acestea, în această familie de receptori există, de asemenea, șapte domenii transmembranare.

Rolul critic al GHRH este demonstrat de șoarecele lit pitic care are o mutație punctiformă în receptorul GHRH (18, 19). Wajnrajch și colab. (20) au descris o mutație fără sens (Glu 72stop) în receptorul GHRH uman care cauzează insuficiență de creștere și deficit de GH la doi copii din aceeași familie de musulmani indieni. Maheshwari et al. (21) au descris un neam din Valea Sindh din Pakistan cu aceeași mutație. Membrii acestui neam au o statură extrem de mică. O altă mutație a receptorului a fost descrisă la o mare familie braziliană care include peste 110 persoane afectate de deficit sever de GH și de statură extrem de mică (22). Aceste experimente din natură demonstrează că un defect în receptorul GHRH afectează creșterea normală și subliniază importanța vitală a GHRH.

O caricatură a receptorului GHRH este prezentată în Fig. 7 (10). Acidul aspartic de la poziția 60 de la codonul de start este locul mutației de șoarece lit. Pentru studierea membranelor din celulele HEK293 transfectate cu ADN complementar pentru receptorul GHRH s-a folosit Western blotting utilizând un antiserum pentru receptorul GHRH C-terminal care a fost crescut la o peptidă bazată pe secvența receptorului GHRH uman. Studiile indică faptul că receptorul de șoarece lit este tradus în proteină și este de fapt prezent în membrana celulelor hipofizare la șoarecele lit. Am propus că această mutație duce la o modificare a structurii terțiare a receptorului, care împiedică legarea (23). Utilizând sonde de foto afinitate, dovezile noastre sugerează că alte situsuri se află în imediata apropiere a GHRH legat, ceea ce indică faptul că mai multe situsuri de interacțiune sunt probabil necesare pentru transducția semnalului. Disponibilitatea receptorului recombinant face fezabilă căutarea de agoniști non-peptidici ai GHRH.

În concluzie, cunoștințele adunate din observarea atentă a unui singur pacient cu acromegalie au condus la izolarea, caracterizarea și sinteza GHRH. Studii suplimentare au condus la introducerea tratamentului cu GHRH al deficitului de GH. Ulterior, noi și alții am reușit să clonăm receptorul pentru GHRH. Studiile cu GHRH au confirmat faptul că acesta este esențial pentru sinteza GH și pentru o creștere normală. Această poziție este acum validată de observațiile conform cărora mutațiile receptorului GHRH, care duc la inactivarea acestuia, conduc la o deficiență profundă de GH și la o statură mică severă și completează cercul înțelegerii noastre privind reglarea GH de către GHRH.

Recunoștințe

Le mulțumesc numeroșilor mei colegi care au avut contribuții importante la această lucrare, precum și doamnei Suzan Pezzoli pentru asistență în pregătirea acestui manuscris.

Această lucrare a fost susținută parțial de granturile NIH HD-13197, DK-32632 și DK-45350 (către M.O.T.) și de grantul RR-00847 (către Centrul General de Cercetare Clinică și Laboratorul CDMAS de la Universitatea din Virginia.

.