Abstract

Infecția cronică activă cu virusul Epstein-Barr (CAEBV) este o boală severă cu o activare neobișnuită a EBV care persistă timp de ani de zile, iar patogeneza sa este în mare parte necunoscută. După crearea unui sistem precis și reproductibil de reacție în lanț a polimerazei pentru a cuantifica ADN-ul EBV, încărcăturile virale în limfocitele din sângele periferic (PBL) au fost determinate la 54 de copii: 15 cu CAEBV, 16 cu mononucleoză infecțioasă (IM) și 23 de copii sănătoși. Copiii cu CAEBV și cei cu IM au avut încărcături virale ridicate. Încărcături mai mici au fost detectate la 47% dintre donatorii sănătoși seropozitivi. Au existat două diferențe distincte între copiii cu CAEBV și cei cu IM: Primii au avut o replicare virală mai mare (103-107 copii/PBL)2,5 × 105 PBL) decât cei cu IM, iar replicarea virală a scăzut la copiii cu IM, în timp ce replicarea activă a persistat ani de zile la subiecții cu CAEBV. Persistența încărcăturilor virale ridicate este un posibil criteriu de diagnostic pentru CAEBV. Sarcinile EBV pot permite clasificarea și prognosticul infecțiilor cu EBV.

Virusul Epstein-Barr (EBV) este un agent cauzal al mononucleozei infecțioase (IM) și al infecției cronice active cu EBV (CAEBV). CAEBV este o boală severă cu o activare neobișnuită a EBV care poate fi fatală cu insuficiență multiplă de organe și este asociată cu limfom malign fără imunosupresie prealabilă . Simptomele clinice ale CAEBV și anomaliile serologice care corespund replicării active a EBV, cum ar fi anticorpii anti-EA-DR marcat crescuți și absența anticorpilor împotriva antigenului nuclear Epstein-Barr (EBNA), persistă timp de luni până la ani de zile. EBV se replică în celulele NK , T și B.

După ce infecția este stabilită, EBV locuiește de obicei în limfocitele B pe toată durata vieții gazdei fără a provoca simptome clinice (desemnată ca infecție latentă). Prin urmare, nu numai detectarea, ci și cuantificarea EBV în țesuturile afectate este esențială pentru a investiga boala EBV.

Pentru a clarifica starea de replicare a EBV la persoanele cu CAEBV, am folosit reacția în lanț a polimerazei în lanț (PCR) semi-cantitativă a ADN pentru a evalua și compara încărcăturile de virus în limfocitele din sângele periferic (PBL) la 3 grupuri de copii: unul cu CAEBV, unul cu IM și controale sănătoase. Sistemul nostru de detecție a fost considerat precis și fiabil pentru cuantificarea EBV, deoarece am amplificat o regiune cu o singură copie a EBV. Majoritatea studiilor anterioare au vizat regiunea BamHI-W, pentru care frecvența de reiterare a repetițiilor în tandem este inconstantă. Considerăm că acest studiu este primul și cel mai amplu studiu la scară largă al încărcăturilor de virus în PBL ale copiilor cu CAEBV.

Materiale și metode

Pacienți și controale

Am examinat 16 copii cu IM (11 băieți, 5 fete; vârste, 0-8 ani), 15 cu CAEBV (11 băieți, 4 fete; vârste, 4-19 ani), 19 persoane sănătoase imunocompetente seropozitive la EBV (10 băieți, 9 fete; vârste, 1-19 ani) și 4 copii sănătoși seronegativi (3 băieți, 1 fată; vârste, 1-10 ani). Toți subiecții cu MI au prezentat manifestări clinice tipice (de exemplu, febră, amigdalită, limfadenopatie, hepatosplenomegalie, disfuncție hepatică și limfocitoză atipică). Diagnosticul de IM a fost pus pe baza constatărilor serologice de anticorpi IgM la antigenul capsidelor virale (VCA) sau a seroconversiei VCA IgG și/sau EA și a anticorpilor EBNA negativi . Douăzeci și două de probe de sânge au fost recoltate de la 16 copii cu IM la 8 zile până la 8 luni de la debutul bolii (simptomul inițial a fost febra la toți pacienții). CAEBV a fost diagnosticat prin criteriile lui Rickinson . Copiii cu CAEBV au avut febră intermitentă sau persistentă timp de >16 luni, cu hepatosplenomegalie, limfadenopatie și/sau erupții cutanate. Rezultatele de laborator au arătat niveluri ridicate ale transaminazelor, anemie, trombocitopenie și/sau hipergamaglobulinemie policlonală. Examenul serologic a evidențiat o creștere marcată a titlurilor de anticorpi împotriva VCA și EA. Infecția cu virusul imunodeficienței umane și bolile reumatice au fost excluse. Niciun subiect nu a suferit un transplant sau nu a urmat un tratament anticanceros.

Eșantioane

Au fost recoltate probe de sânge periferic de 2 ml heparinizate. PBL au fost izolate prin ficol-hypaque și lizate cu 0,15 μg/μL de proteinază K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); ADN-ul a fost extras prin precipitare cu fenol-cloroform-etanol. ADN-ul extras a fost cuantificat prin spectrofotometru, ajustat la 0,25 μg/μL ADN și utilizat ca șabloane PCR.

Sensibilitatea PCR

EBV ADN provenea din trei surse: Raji, care conținea 50 de copii de EBV pe celulă ; Akata, care conținea 20 de copii pe celulă; și fragmente BamHI-L clonate, care au fost amestecate cu ADN din celule de sânge din cordonul ombilical și utilizate ca standard pozitiv. Pentru a determina sensibilitatea sistemului PCR, diluții seriale de 10 ori (10°-104 copii de EBV) ale ADN-ului extras au fost supuse PCR.

PCR

A nested double PCR a fost conceput pentru a amplifica regiunea conservată care codifică gp220 (în cadrul fragmentului BamHI-L) . Perechea de amorsă exterioară amplifică un fragment de 302-bp, prin utilizarea oligonucleotidelor 5′-GCGAACTACTGGTGGACACACATGA și 5′-AA-GTCCACACAGGCAAATGCCA, care corespund pozițiilor 2870-3171 din B95-8 (GenBank M10593). Perechea interioară amplifică un fragment de 239-bp . PCR a fost efectuată într-o reacție de 50 μL care conține 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM din fiecare amorsă, 2,5 U de Taq ADN polimerază (Boehringer-Mannheim) și 4 μL de ADN de probă. Produsele amplificate au fost analizate pe agaroză 2% și colorate cu bromură de etidiu, iar pentru confirmarea specificității s-a folosit Southern blotting, utilizând fragmentul BamHI-L ca sondă. Fiecare reacție PCR a fost efectuată în triplu exemplar și a inclus controlul negativ pentru a exclude contaminarea încrucișată. Pentru a confirma specificitatea PCR, a fost analizat ADN din virusul herpes simplex de tip 1 și 2, virusul varicelo-zosterian, citomegalovirusul uman și virusurile herpetice umane-6 și -7. Nu s-a observat nicio amplificare specifică.

Cantificarea genomului EBV

Cantitatea de ADN EBV în PBL a fost determinată prin experimente de diluție limitativă. Diluții seriale de 10 ori (1-10-6μg) de ADN genomic extras din fiecare probă de ADN au fost supuse la nested PCR, așa cum a fost descris mai sus, iar limita minimă pentru rezultatul pozitiv a fost convertită în încărcătura virală (copii/2,5 × 105 celule).

Rezultate

Sensibilitatea sistemului PCR a fost determinată cu atenție prin diluții de 10 ori a celor trei surse de ADN EBV: Raji și Akata, ambele conținând un număr constant de copii de ADN EBV pe celulă, și fragmentul BamHI-L clonat. Raji conține 50 de copii ale genomului EBV pe celulă, iar 1 μg de ADN genomic din celulele Raji este egal cu cel extras din 2,5 × 105 celule: prin urmare, 1,25 × 107 copii de ADN EBV. ADN-ul din Raji a fost diluat în mod corespunzător, iar ADN-ul care conținea 10n copii (diluții în serie de 10°-104 copii ale virusului) a fost supus amplificării. S-a examinat limita minimă pentru un rezultat pozitiv al PCR. Examinările repetate au arătat că sensibilitatea a fost de 100 de copii pe reacție, cu reproductibilitate. Rezultatele au fost aceleași folosind ADN Akata și cu experimentul de diluție folosind 10n copii ale fragmentelor BamHI-L amestecate cu 105μg, 102μg și fără ADN de celule sanguine din cordonul ombilical.

Toate PBL de la subiecții cu IM și CAEBV au fost pozitive pentru genomul EBV. Nouă (47%) din 19 probe de la persoane sănătoase seropozitive la EBV au fost pozitive. Toate PBL de la persoane seronegative au fost negative.

ADN-ul EBV în PBL a fost cuantificat și comparat pentru controalele sănătoase EBV-seropozitive, copiii cu IM și copiii cu CAEBV (figura 1). La copiii sănătoși EBV-seropozitivi, încărcăturile de virus au fost de 100-1000 de copii la 2,5 × 105 PBL. În PBL de la copiii cu IM, cele mai mici limite pentru rezultatele pozitive ale PCR au variat de la 10° μg (2,5 × 105 PBL) la 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) de ADN genomic, indicând că încărcătura virală a fost de 100-100.000 de copii/2,5 × 105 PBL. Trei probe de sânge recoltate în decurs de o lună de la debutul bolii conțineau încărcături mai mari (1000-100.000 de copii/2,5 × 105 PBL). PBL recoltate la >11 luni de la debutul MI au avut tendința de a conține cantități mai mici de virus. Am urmărit încărcăturile de virus la 4 pacienți cu IM (figura 2A). La toți 4, încărcăturile de virus au scăzut în timpul evoluției clinice, dar au fost mai mari (100-10.000 de copii/2,5 × 105 PBL) decât la gazdele sănătoase seropozitive.

PBL de la copiii cu CAEBV au avut mai mult ADN EBV decât probele de la copiii cu IM. Patru pacienți cu CAEBV au fost urmăriți timp de >16 luni (figura 2B ilustrează constatările pentru 2 pacienți). Alți doi pacienți au avut încărcături virale neschimbate pe parcursul a 2-3 ani (105 și 106 copii/2,5 × 105 PBL, respectiv). Toți acești pacienți au avut sarcini virale persistent ridicate, spre deosebire de constatările cu IM. Când am examinat relația dintre manifestările clinice și încărcăturile EBV, doar febra a fost corelată cu încărcătura virală. Nu a existat nicio corelație cu hepatosplenomegalia, limfadenopatia, exantemul, alergia la țânțari, disfuncția hepatică, anemia, trombocitopenia sau titlurile serice de anticorpi împotriva VCA, EA-DR și EBNA.

Discuție

PCR care cuantifică ADN-ul EBV a demonstrat că PBL de la copiii cu CAEBV sau IM au avut încărcături virale ridicate, ceea ce indică o replicare activă a EBV în limfocite. Replicarea virală a fost considerată mai activă în CAEBV decât în IM; în grupul IM, replicarea a scăzut treptat, în timp ce replicarea activă a persistat ani de zile la pacienții cu CAEBV.

Sistemul nostru PCR amplifică secvențele specifice EBV care codifică gp220, care este o genă cu o singură copie într-un virus, în timp ce studiile anterioare au vizat repetarea internă lungă situată în regiunea BamHI-W. Deoarece în proliferarea EBV policlonală numărul de repetări din această regiune este inconstant, sistemul nostru este considerat mai precis pentru cuantificarea EBV, deși mai puțin sensibil pentru detectare. Defectul de sensibilitate scăzută a fost depășit prin utilizarea PCR nested. Sensibilitatea a fost de 100 de copii pe reacție, în comparație cu 10 copii în raportul anterior . Am cuantificat genomurile EBV în PBL prin diluția în serie a ADN-ului extras. Sistemul nostru de cuantificare a ADN-ului EBV prin diluții seriale ale ADN-ului extras s-a dovedit a fi reproductibil și fiabil.

PBL colectate de la copiii cu IM și cu CAEBV au găzduit cantități mai mari de genom EBV decât PBL de la controale seropozitive sănătoase. Dintre aceștia din urmă, 47% au avut ADN EBV detectabil (100-1000/2,5 × 105 PBL). La 2 subiecți, EBV a fost detectat la niveluri mai ridicate decât în studiile anterioare (1-50/106 PBL) . Deoarece am studiat copii, perioadele mai scurte după infecția primară pot contribui la încărcăturile EBV mai mari decât cele observate în studiile anterioare la adulți, reamintindu-ne că, în special la copii, rezultatele pozitive ale PCR includ infecția EBV latentă asimptomatică.

Copiii cu IM aveau cantități mari de EBV. Încărcăturile EBV au atins un vârf la o lună după debut (1000-100.000 de copii/2,5 × 105 PBL) și apoi au scăzut treptat, dar au rămas ridicate la câteva luni (⩽8) după debut, în comparație cu nivelurile la controalele sănătoase. Chiar și atunci când manifestările clinice au dispărut, nivelurile relativ ridicate de replicare a EBV au continuat în PBL.

Pacienții cu CAEBV au avut în mod persistent cantități mari de EBV, sugerând că replicarea activă cronică nereglementată a EBV în PBL are ca rezultat o boală severă cu un prognostic prost. Factorii și mecanismele care conduc la replicarea virală activă surprinzător de activă rămân neclare. Au fost descrise diverse deficiențe eterogene în sistemele de apărare ale gazdei, atât ale imunității umorale, cât și ale celei celulare, care ar putea permite replicarea virală activă. O încărcătură virală ridicată în PBL (>1300.000 EBV/105 PBL) a fost demonstrată în boala limfoproliferativă posttransplant asociată cu EBV (PTLD), o complicație după transplanturi , deși încărcătura virală a scăzut în decurs de un an, în paralel cu recuperarea de la imunosupresie. O diferență cantitativă a încărcăturii circulante de EBV a fost corelată cu nivelul anticorpilor EBNA în PTLD, dar nu și în CAEBV. Prin urmare, comportamentul EBV în PTLD a fost considerat a fi atât similar, cât și diferit de cel din CAEBV. Având în vedere manifestările clinice, CAEBV pare similar cu sindromul limfoproliferativ legat de X (XLP) , pentru care a fost identificată recent gena responsabilă. Cu toate acestea, spre deosebire de sindromul XLP, CAEBV nu este o boală ereditară, iar persoanele de sex feminin pot fi afectate. Este necesară o analiză imunologică suplimentară a CAEBV pentru a clarifica factorii predispozanți pentru activarea virală.

Aciclovirul, interferonul-α și interleukina-2 au fost utilizate pentru a trata CAEBV – cu rezultate nesatisfăcătoare . Rezultatele noastre indică faptul că medicamentele citotoxice care induc imunosupresie și sporesc activarea virală ar trebui să fie alese cu atenție, deși caracteristicile clinice sunt similare cu cele ale malignităților hematologice. Persistența încărcăturilor ridicate de EBV în PBL este un posibil criteriu de diagnostic pentru CAEBV și poate fi utilă pentru monitorizarea activității bolii, pentru clasificarea bolii și pentru prezicerea prognosticului.

Recunoștințe

Îi mulțumim lui George Klein (Centrul de Microbiologie și Tumorbiologie, Institutul Karolinska, Stockholm) pentru revizuirea manuscrisului și lui Sachi Takemoto și Ai Kitamura pentru asistența tehnică abilă.

.