- Abstract
- 1. Introducere
- 2. Principiul imunoanalizei cu microlentile
- 3. Structura și funcțiile unui instrument de imunoanaliză cu microlentile
- 3.1. Sistem de iradiere cu lumină paralelă
- 3.2. Sistem de formare a imaginilor cu autofocalizare de înaltă rezoluție
- 3.3. Sistem automat inteligent de recunoaștere și analiză a imaginilor
- 3,4. Sistemul de control al temperaturii
- 3.5. Placă de testare cu microlentile
- 4. Aplicarea sistemului de imagistică cu microsfere imune
- 4.1. Măsurarea reacției antigen-anticorp
- 4.2. Măsurarea probelor clinice
- 5. Fezabilitatea imagisticii cu microsfere imune pentru detectarea antigenului și a anticorpilor
- 6. Concluzii
- Conflicte de interese
- Contribuții ale autorilor
- Recunoștințe
Abstract
Detecția și analiza reacției antigen-anticorp este una dintre cele mai importante tehnici de detecție în domeniile medicinei, biologiei, științei mediului și siguranței alimentare. Metodele tradiționale și clasice de detectare a antigenului și a anticorpului întâmpină multe probleme, cum ar fi consumul de timp, costul ridicat și precizia scăzută. O nouă tehnică de imagistică a microsferelor imune prin intermediul microlentilelor este utilizată pentru a testa modificările indicelui de refracție înainte și după reacția antigen-anticorp. Aceasta poate efectua rapid determinarea calitativă și cantitativă pentru reacția antigen-anticorp fără etichetare, premodificare, post-spălare și enzime costisitoare. Aici, prezentăm și discutăm principiul și avantajele sale, structura unui instrument de imunoanaliză cu microlentile și potențialul de măsurare a probelor clinice. Este promițător pentru a fi dezvoltat pentru aplicarea la diagnosticarea bolilor clinice.
1. Introducere
Tehnicile comune disponibile în prezent pentru detectarea antigenelor și a anticorpilor includ testul imunoenzimatic (ELISA), rezonanța plasmonului de suprafață (SPR), radioimunodozarea (RIA), testul imunocromatografic cu aur coloidal (GICT), testul de imunofluorescență indirectă (IFA), testul imunologic cu chemiluminescență (CLIA) și imunodozarea turbidimetrică îmbunătățită cu particule (PETIA). ELISA combină amplificarea reacției catalizate de enzime și reacția specifică a antigenului și a anticorpului cu o precizie ridicată și costuri reduse, dar procedurile sale sunt complicate, cu un control riguros al condițiilor . SPR a fost dezvoltat în anii 1990 pentru a detecta interacțiunea dintre biomolecule și alte molecule, și nu necesită etichetare și poate obține rezultatul rapid, dar echipamentul său este scump și are nevoie de un volum mare de probe . RIA are caracteristicile de sensibilitate ridicată, fiabilitate și necesitate redusă a volumului de probă. Este utilizat pe scară largă în detectarea proteinelor, enzimelor și a altor molecule, dar radionuclidul este dăunător pentru sănătate și, de asemenea, alterează activitățile biologice ale probelor, ceea ce duce la erori experimentale . Fiind un nou tip de tehnică de imunoanaliză și una dintre cele mai comune metode de detectare a antigenului și a anticorpilor, GICT este ușor, simplu și rapid, cu costuri reduse, dar dimensiunea eșantionului este limitată și are o sensibilitate scăzută . CLIA, IFA și PETIA sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă în detectarea antigenului și a anticorpilor. Avantajele lor comune sunt foarte precise, stabile, ușoare și rapide, dar cu costuri ridicate și volum mare de probă .
O tehnică de imagistică cu microlentile imune pentru a testa modificarea indicelui de refracție poate sparge limitările metodelor de mai sus. Este rapidă, sensibilă și simplă, cu nepoluare și costuri reduse pentru detectare și se așteaptă să fie aplicată pe scară largă la instituțiile medicale primare . Această tehnică constă în iradierea paralelă a luminii, o cameră de înaltă rezoluție, un software de analiză inteligent, un autofocus și sisteme de control al temperaturii cu o placă de testare a probelor cu microlentile cu mai multe puțuri și poate realiza detectarea în mai multe treceri a antigenului și a anticorpilor . Sistemul de cameră de înaltă rezoluție poate satisface cerințele imagisticii cu microlentile, iar utilizarea controlerului de temperatură, a autofocalizării și a sistemelor automate de analiză inteligentă poate reduce foarte mult erorile din experimente pentru o măsurare precisă.
2. Principiul imunoanalizei cu microlentile
Microlensul este o lentilă cilindrică cu un capăt de suprafață sferică și celălalt capăt este o suprafață plană. Are un efect puternic de amplificare și îmbunătățește semnificativ capacitatea de imagistică a microscopului optic tradițional . Atunci când o microlentilă cu o rază de și un indice de refracție (RI) de este scufundată într-o soluție de () și iluminată cu lumină plană, datorită efectului de refracție, imaginea sa este una rotundă cu un inel întunecat la margine . Relația dintre raza punctului luminos din imagine și alți parametri, cum ar fi , , , și înălțimea cilindrică a microlentilei este prezentată după cum urmează :unde este unghiul de incidență a luminii asupra vârfului sferic al microlentilei și . Pe baza acestei formule, modificările instantanee ale mediului pot fi determinate prin măsurarea razei petei luminoase din imagine și a razei microlentilelor. Deoarece refracția optică are loc cu viteza luminii, orice variație instantanee RI în mediul înconjurător al microlentilelor poate induce imediat o modificare a razei spotului luminos central. Prin urmare, metoda poate monitoriza modificarea instantanee a RI/concentrației cu ajutorul unei camere de mare viteză pentru imagistică (figura 1).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3. Structura și funcțiile unui instrument de imunoanaliză cu microlentile
Cum se arată în figura 2, sursa de lumină paralelă, imagistica de înaltă rezoluție, analiza automată inteligentă, sistemele de autofocalizare și de control al temperaturii și o placă de testare cu microlentile cu mai multe godeuri compun un instrument de imunoanaliză cu microsfere . Atunci când sursa de lumină paralelă emite lumină paralelă către microlentile, sistemul de imagistică autofocus de înaltă rezoluție obține o imagine focalizată în câteva milisecunde. Apoi, imaginea imună a microsferelor este analizată de sistemul software de analiză inteligentă pentru a deduce valorile de și , precum și concentrația de antigen/anticorp. Funcția sistemului de control al temperaturii este de a regla diferite temperaturi cerute pentru diferite reacții antigen-anticorp. Întregul proces nu durează mai mult de 2 minute.
3.1. Sistem de iradiere cu lumină paralelă
Ledul ca sursă de lumină paralelă produce o zonă de iluminare paralelă cilindrică, care este similară cu un condensator original cu avantajele unui cost redus, ciclu de viață lung, performanță luminoasă perfectă și scară mică . După cum se arată în figura 3, lumina paralelă reală poate fi primită datorită refracției lentilei . În zona de iradiere a LED-ului, lentila poate schimba direcția și distribuția luminii prin configurarea lentilei relevante, astfel încât să se obțină lumina paralelă reală (figura 3).
3.2. Sistem de formare a imaginilor cu autofocalizare de înaltă rezoluție
Acest sistem este format dintr-o cameră digitală de mare viteză și un sistem de autofocalizare. În prezent, viteza de imagistică a unor camere digitale comerciale a depășit 10.000 de cadre pe secundă . Prin urmare, sistemul de imagistică de înaltă rezoluție poate realiza monitorizarea în timp real a modificărilor dinamice ale RI în soluție. O cameră CCD cu un număr mare de pixeli joacă un rol important în obținerea unei imagini cu microlentile de înaltă rezoluție . Nucleele sistemului de autofocalizare constau în identificarea imaginii, procesarea imaginii și părțile de control . Imaginile colectate de sistemul de camere sunt analizate, iar evaluarea clarității este prezentată. În funcție de această evaluare, sistemul este condus automat către o zonă sau o direcție corespunzătoare până când rezoluția imaginilor achiziționate satisface cerința prestabilită.
3.3. Sistem automat inteligent de recunoaștere și analiză a imaginilor
Sistemul automat de analiză inteligentă realizează în principal recunoașterea imaginilor și analiza datelor privind imagistica microlentilelor, astfel încât să monitorizeze variația instantanee a în imaginea sa și să deducă astfel modificarea indicelui de refracție al soluției de probă în timpul procesului de reacție antigen-anticorp. Precizia sa este strâns legată de calitatea imaginii, iar parametrii precum pixelul, dimensiunea pixelului și rezoluția afectează în mod direct măsurarea RI . În cazul în care se exploatează camera digitală CCD cu ≥10 milioane de pixeli și o dimensiune mică a pixelilor care ajunge la mai puțin de 3 nm și o microlentilă cu raza de 600 μm, modificarea indicelui de refracție se determină prin modificări ale raportului dintre pata luminoasă centrală și raportul dintre raza inelului exterior, astfel încât modificarea indicelui de refracție măsurată poate ajunge la 10-6 .
3,4. Sistemul de control al temperaturii
Sistemul de control al temperaturii este o placă de sticlă securizată transparentă cu o peliculă subțire de oxid de indiu-staniu și controlată de o precizie ridicată a unui regulator de temperatură PID (proporțional-integral-derivat). Acesta permite ca temperatura probei din placa de testare cu microlentile cu mai multe godeuri să ajungă rapid la o valoare stabilită în 2 minute și să fie menținută în intervalul de variație de 0,1°C pentru ca reacția antigen-anticorp să fie eficientă .
3.5. Placă de testare cu microlentile
O placă cu microlentile cu mai multe godeuri este special concepută pentru un instrument de imunoanaliză cu microlentile. Este fabricată din material de polimetilmetacrilat (PMMA) și este, în general, pregătită ca 2 sau 16 godeuri trapezoidale pentru a satisface diferite cerințe de detecție. În interiorul fiecărei godeuri, în partea inferioară se află o microlentilă cu o rază de câteva sute de microni. Aplicarea plăcii cu microlentile asigură o condiție obiectivă pentru detecția multicanal. Deoarece diametrul părții inferioare a godeului este de doar aproximativ 2 mm, câțiva microlitri de soluție de probă sunt suficienți pentru a îneca microlentilă pentru detecția antigen-anticorp.
4. Aplicarea sistemului de imagistică cu microsfere imune
4.1. Măsurarea reacției antigen-anticorp
Huang și colegii săi au detectat diferite tipuri de reacții antigen-anticorp și au aflat caracteristicile lor regulate. În primul rând, indicele de refracție s-a modificat odată cu timpul de reacție în procesul de reacție antigen (Ag)-anticorp (Ab). În al doilea rând, au existat trei faze de variație a RI cu timpul de reacție, inclusiv perioade de creștere rapidă, relativ stabile și perioade de scădere lentă. Prima etapă a fost legată de combinarea Ag și Ab, astfel încât RI a crescut brusc odată cu combinarea rapidă a Ag și Ab pentru a forma complexe. Maximul de RI este în cea de-a doua fază. În al treilea rând, concentrația de Ag sau Ab a avut o mare influență asupra RI. Astfel, prin obținerea modificării RI în funcție de concentrația Ag sau Ab, conținutul acestora în probele testate poate fi calculat prin curba de ajustare. În al patrulea rând, diferiți anticorpi, cum ar fi Ab de captură și Ab de sondare, ar influența, de asemenea, variația RI. Utilizând această tehnică pentru a măsura reacțiile antigen-anticorp prin mai multe sisteme Ag-Ab, relațiile dintre modificarea indicelui de refracție și concentrațiile mai multor tipuri de soluții antigen-anticorp (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, fosfataza alcalină placentară (PAP) Ag-Ab, kallikreina 6 (KLK6) Ag-Ab, gonadotropina corionică umană (HCG) Ag-Ab, troponina cardiacă (cTnI) Ag-Ab, proteinele de legare a acizilor grași (FABP) Ag-Ab și soluțiile de proteină C-reactivă (CRP) Ag-Ab) au putut fi obținute (figura 4). După cum știm că asocierea și disocierea complexului antigen-anticorp este un proces dinamic, pe baza curbei RI vs. timp și calcularea derivatei cu timpul, se pot obține, de asemenea, informații despre constantele de viteză de asociere și disociere și (Figura 4(a)) și alți parametri termodinamici prin utilizarea următoarei ecuații:
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4.2. Măsurarea probelor clinice
Tehnica de imagistică cu microsfere imune a fost utilizată în continuare pentru a testa probe clinice. 36 de probe clinice au fost detectate prin aceasta pentru concentrațiile de CRP Ag. Abaterea standard relativă a acesteia este de aproximativ 2-10% în comparație cu imunocromatografia, iar coeficientul de corelație între rezultatele dobândite prin cele două modalități ajunge până la 0,989 (figura 5). Este bine cunoscut faptul că probele de ser hemolizat clinic pot avea un impact considerabil asupra acurateței rezultatelor detectate prin utilizarea metodelor tradiționale. Dimpotrivă, imaginile microlentilelor din probele hemolizate sunt încă clare prin această tehnică. Erorile relative dintre valorile antigenelor detectate în probele cu hemoliză și cele fără hemoliză sunt de doar aproximativ 2%, ceea ce indică influența mai mică a probelor de ser hemolizat asupra acurateței rezultatelor .
5. Fezabilitatea imagisticii cu microsfere imune pentru detectarea antigenului și a anticorpilor
Majoritatea antigenelor sunt proteine, în timp ce câteva sunt polizaharide, acizi nucleici și alte substanțe, iar toți anticorpii sunt proteine. Deoarece proteina conține o cantitate mare de amido și carboxil, aceste grupări polare fac ca particulele coloidale să producă o sarcină electrică datorită acțiunii electrostatice, iar particulele cu aceeași sarcină au fost respinse între ele. În același timp, grupele polare care sunt puternic hidrofile reacționează cu moleculele de apă și formează un strat de hidratare pentru a produce un coloid hidrofil, asigurându-se că proteina nu se aglomerează pentru a forma un precipitat, astfel încât particulele coloidale să fie dispersate uniform într-o soluție .
Când antigenul este combinat cu anticorpul, sarcina electrică a particulelor coloidale se reduce sau dispare, iar stratul de hidratare, de asemenea, dispare sau devine subțire. Proteina se transformă din coloid hidrofil în coloid hidrofob . În mediul de electrolit, particulele coloidale se aglomerează în continuare pentru a forma complexele antigen-anticorp care pot fi realizate cu ajutorul ochilor . Indicii de refracție ai coloidului hidrofil și hidrofob sunt remarcabil de diferiți. Prin urmare, această tehnică poate monitoriza modificările dinamice ale indicelui de refracție pentru a judeca dacă au loc reacții între antigen și anticorp într-o soluție. Se poate stabili o curbă standard în funcție de o relație între concentrația antigenului și a anticorpului și timpul de reacție al acestora. Complexul devine mai mare odată cu procesul de reacție antigen-anticorp, iar modificarea indicelui de refracție devine, de asemenea, mai evidentă. Utilizând curba standard, este ușor de cuantificat concentrația anticorpului sau a antigenului detectat.
S-a demonstrat că un anticorp care este complementar epitopilor unor antigeni diferiți ar induce într-adevăr o creștere similară a RI în reacția Ag-Ab cu ajutorul imunoanalizei imagistice cu microlentile. După cum se arată în figurile 4(b) și 4(c), măsurătorile de antigen au fost efectuate utilizând Ab de captare și Ab de sondare sau Ab monoclonal și Ab policlonal pentru un anumit antigen. Din curbe, se poate observa că nu a existat nicio diferență semnificativă între cele două tipuri de anticorpi în ceea ce privește inducerea de modificări în timpul reacției Ag-Ab, ceea ce indică faptul că imunoanalizatorul de imagistică cu microlentile poate utiliza diferite tipuri de anticorpi, fie Ab de captare sau de sondare, fie Ab monoclonal sau policlonal pentru detecție. Cu toate acestea, se preferă Ab monoclonal pentru imunoanalizatorul cu microlentile de formare a imaginii, deoarece acesta nu numai că induce o reacție mai mare prin afinitatea sa mai mare față de antigen, dar reduce, de asemenea, posibilitatea unei reacții încrucișate fals pozitive, astfel încât antigenele pot fi detectate la concentrații mai mici. În general, reacția încrucișată este teoretic inevitabilă în cazul acestei tehnici, ca și în cazul altor mijloace implicate în imunoanaliză. Cu alte cuvinte, specificitatea imagisticii cu microlentile imune depinde în totalitate de cea a anticorpilor selectați împotriva antigenului țintă. Prin urmare, este foarte important să se selecteze anticorpii adecvați și să se optimizeze sistemul de reacție Ag-Ab.
6. Concluzii
Această tehnică de imagistică cu microlentile imune poate măsura rapid și precis RI a diferitelor probe și poate monitoriza în timp real modificările RI în procesul de reacție între antigen și anticorp. RI se modifică odată cu modificările concentrației de Ag sau Ab. Astfel, în funcție de modificarea RI în funcție de concentrația Ag sau Ab, conținutul probelor poate fi calculat calitativ și cantitativ fără etichetare, premodificare, post-spălare și enzime costisitoare. În comparație cu modalitățile convenționale de detecție, avantajele acestei metode sunt: precisă, fiabilă, rapidă (finalizată în câteva minute) și simplă, fără poluare. În plus, limita sa de detecție este la fel de mică ca pg/ml, ceea ce necesită doar câțiva μl suficienți pentru a efectua detecția și este, de asemenea, potrivită pentru probele clinice hemolizate care sunt dificil de detectat cu metodele tradiționale. Mai mult, este neintruziv pentru probe. Sistemul de iradiere cu lumină paralelă, sistemul de camere de înaltă rezoluție, sistemul de analiză automată inteligentă, sistemul de focalizare automată, sistemul de control al temperaturii și placa de detecție poroasă cu microlentile compun instrumentul de imunoanaliză cu microsfere. Acesta este mic și ușor de transportat.
Este bine cunoscut faptul că reacția antigen-anticorp este influențată în mare măsură de concentrația proprie, temperatura, pH-ul și soluția electrolitică. Din acest motiv, acești factori sunt luați în considerare în sistemul de imagistică cu microlentile pentru a menține datele stabile prin echilibrarea modificărilor acestora. De exemplu, acest sistem poate fi optimizat prin selectarea unor materiale adecvate pentru o placă de testare care să ofere un loc de reacție antigen-anticorp și prin transformarea plăcii în hidrofilă pentru a evita interferențele hidrofobe. Precizia de detectare poate fi îmbunătățită în continuare prin ajustarea proporției antigen-anticorp, prin selectarea unui diluant adecvat, prin modificarea acestora cu ioni metalici și așa mai departe.
Detecția antigenului și a anticorpilor este relativ semnificativă în domeniile de investigație biomedicală, diagnostic clinic, analiză a medicamentelor, siguranță alimentară și monitorizare a mediului. Având în vedere preocupările oamenilor cu privire la sănătatea mediului, siguranța alimentară și asistența medicală, dezvoltarea unui instrument sensibil cu costuri reduse, precizie ridicată, dimensiuni reduse, portabilitate și operare simplă a devenit o nevoie socială urgentă. Astfel, această tehnică de imagistică cu microlentile imune este promițătoare pentru a fi aplicată pe scară largă în diverse domenii și potrivită pentru a fi popularizată în special la nivelul comunității și în mediul rural.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Contribuții ale autorilor
Jiahui Liang și Xiaotian Ye au contribuit în mod egal la această lucrare.
Recunoștințe
Suntem recunoscători pentru sprijinul financiar acordat de Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (număr de grant: 201604020146) și de National Natural Science Foundation of China (numere de grant: 81172824 și 30971465).
.