Fungii examinate

Soldații de Escovopsioides au fost obținuți din grădinile de ciuperci ale diferitelor specii de furnici tăietoare de frunze și non-tăietoare de frunze colectate în studii anterioare. Această colecție cuprinde 20 de izolate obținute de la Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi și Trachymyrmex tucumanus, în plus față de specia tip de E. nivea obținută de la Acromyrmex subterraneus subterraneus (tabelul 3). De asemenea, un izolat suplimentar a fost obținut dintr-o colonie de furnici care nu taie frunzele Apterostigma megacephala găsită în Parauapebas, Pará, Brazilia (tabelul 3). Toate izolatele au prezentat caracteristicile morfologice descrise ale genului Escovopsioides: colonii hialine pe PDA, vezicule terminale și intercalare purtând fialoizi lageniformi, conidii hialine în lanțuri lungi, aleuroconidii și structuri asemănătoare clamidosporilor .

Izolatele sunt păstrate sub formă de suspensii de conidii la – 80 °C (în glicerol 10%) și în apă distilată la 10 °C în colecția Laboratorului de Ecologie și Sistematică Fungică (LESF), Rio Claro, statul São Paulo, Brazilia. Toate izolatele au fost reactivate din stocuri prin inocularea de conidii conservate pe mediul PDA și incubate timp de 7 zile la 25 °C, la întuneric. Toate izolatele examinate au fost obținute sub formă de culturi monosporice.

Caracterizarea moleculară a Escovopsioides

ADN-ul genomic a fost extras prin metoda CTAB din culturile crescute pe agar malț 2% (MA2%) timp de 5 zile, la întuneric. Genele care codifică pentru tef1 (amorsă: EF6-20F și EF6A-1000R), LSU (amorsă: CLA-F și CLA-R), precum și ITS (amorsă: ITS5 și ITS4) au fost amplificate pentru toate izolatele. Pentru tef1, 1 μL de ADN genomic diluat (1:100) a fost utilizat ca șablon pentru amplificare cu ajutorul Illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) în următoarele condiții: o etapă inițială de denaturare la 94 °C timp de 2 minute, urmată de 15 cicluri la 94 °C timp de 30 s și o temperatură inițială de recoacere la 65 °C care scade cu 1 °C la fiecare ciclu de atingere și o extensie finală la 72 °C timp de 1 minut. S-a efectuat o a doua etapă PCR: 94 °C timp de 30 s, urmată de 35 de cicluri la 94 °C timp de 30 s, 48 °C timp de 30 s și o etapă finală de extensie la 72 °C timp de 1 min. Pentru ITS, 2 μl de ADN genomic diluat (1:100) au fost utilizați ca șablon pentru PCR, urmând condițiile descrise în Schoch et al.: 94 °C timp de 3 min, urmat de 35 de cicluri la 94 °C timp de 1 min, 55 °C timp de 1 min și o etapă finală de extensie la 72 °C timp de 2 min. Pentru LSU, s-au folosit 2 μl de ADN genomic diluat (1:100) pentru PCR, urmând condițiile descrise în Augustin et al. : 95 °C timp de 2 min, 40 de cicluri de 30 s la 95 °C, 60 s la 62 °C, 90 s la 72 °C și 5 min de extensie la 72 °C. Produsele PCR au fost colorate cu GelRed™ (Biotium) și vizualizate sub UV după electroforeza în gel de agaroză 1%.

Ampliconii au fost purificați cu kitul Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System (Promega), conform protocolului producătorului. Probele au fost analizate în NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) și 20 ng de ADN au fost secvențiate cu ajutorul kitului de secvențiere BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific), conform instrucțiunilor producătorului. Din cauza conținutului ridicat de GC în regiunea ITS a Escovopsioides, în reacțiile de secvențiere s-a adăugat 5 % DMSO. Secvențele înainte și înapoi au fost generate în ABI 3500 (Life Technologies) și asamblate în contigi în BioEdit v.7.1.3 . Secvențele generate în prezentul studiu au fost depuse la NCBI-GenBank (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1).

Analiză filogenetică

În plus față de secvențele generate în acest studiu, secvențele speciei tip (E. nivea), împreună cu cele ale celor șase specii descrise de Escovopsis și opt ciuperci aparținând Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma și Lecanicillium) au fost recuperate de la NCBI-GenBank. Astfel, întregul set de date utilizat în acest studiu a cuprins secvențele a 37 de ciuperci (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1).

Pentru analiza filogenetică, secvențele au fost aliniate în MAFFT . Secvențele de tef1, ITS și LSU au fost concatenate în Winclada v.1.00.08. Inferența bayesiană a fost utilizată ca algoritm de reconstrucție. Modelul de substituție nucleotidică GTR + G și GTR + I + G a fost selectat pentru tef1 și, respectiv, ITS/LSU, utilizând AIC în jModeltest2 cu un interval de încredere de 95%. Astfel, au fost efectuate analize independente partiționate ale setului de date în MrBayes, fiecare cu trei lanțuri încălzite și un lanț rece. Eșantionarea MCMC în fiecare analiză a avut loc până la un milion de generații. Convergența lanțurilor încălzite și reci a avut loc atunci când deviația standard a frecvențelor de divizare a fost mai mică de 0,01; apoi, primele 25% din generații au fost eliminate ca burn-in.

Experimente de cultură dublă

Am efectuat teste in vitro pentru a verifica potențialul antagonist al Escovopsioides față de ciuperca cultivată de furnicile tăietoare de frunze. Am selectat 13 din cele 21 de izolate de Escovopsioides (tabelul 3), pe baza următoarelor criterii: i) orice polimorfism constatat în gena tef1; ii) diferite specii de furnici asociate; iii) locație geografică (adică diferite orașe și locuri de colectare). Doi dintre izolații selectați (LESF 596 și LESF 599) au fost deja evaluați pentru interacțiunile lor cu culturile fungice în studiul lui Varanda-Haifig et al. Cu toate acestea, am replicat acest test pentru a compara cu izolate suplimentare de Escovopsioides.

În experimentele de cultură duală a fost utilizată ciuperca Leucoagaricus gongylophorus FF2006 cultivată de specia de furnici Atta sexdens rubropilosa. Această tulpină este menținută pe pânze de agar prin transferuri succesive la fiecare 24 de zile la 25 °C. Producția de gongylide de către această tulpină este verificată la fiecare ciclu de transfer. Această ciupercă a fost cultivată pe mediu PDA și incubată la 25 °C timp de 14 zile, la întuneric. După această perioadă, fragmente de miceliu (cu diametrul de 8 mm) au fost transferate în noi plăci Petri (90 × 15 mm) conținând, de asemenea, PDA, la o distanță de 1,5 cm de margine. Aceste plăci au fost incubate la 25 °C timp de 14 zile, în întuneric. Apoi, fragmente de miceliu (8 mm în diametru) de Escovopsioides, incubate anterior pe PDA, au fost inoculate la o distanță de 3 cm față de ciuperca mutualistă. Pentru a compara efectele lui Escovopsioides asupra creșterii miceliului ciupercii de cultură cu efectele cauzate de alte ciuperci, am folosit un izolat de Escovopsis sp. (LESF 19) din grădinile de ciuperci de Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brazilia). Acest izolat a fost obținut prin inocularea unor bucăți mici din grădinile de ciuperci pe PDA suplimentat cu cloramfenicol. Plăcile de control au fost inoculate cu aceeași ciupercă mutualistă, însă nu au fost inoculate Escovopsioides sau Escovopsis. Toate plăcile au fost incubate timp de 14 zile la 25 °C, la întuneric. Fiecare combinație de Escovopsioides, Escovopsis și ciuperca mutualistă a fost realizată în zece plăci. Plăcile experimentale și de control au fost scanate la intervale de 0, 2, 3, 5, 7, 10 zile pe un scaner HP Deskjet F2050. Imaginile au fost utilizate pentru a măsura suprafața de creștere a coloniei (cm2) a ciupercii mutualiste în ImageJ v. 1.38 .

Suprafețele de creștere micelială a L. gongylophorus în experimentele de cultură dublă au fost analizate cu ajutorul unei ANOVA mixte cu două căi, cu izolatele fungice (Escovopsioides și Escovopsis) față de martor ca variabilă între subiecți, iar timpul (zile) ca variabilă în cadrul subiecților, luând astfel în considerare măsurătorile repetate ale timpului în cadrul tratamentelor. Datele au fost verificate în ceea ce privește normalitatea și omogenitatea varianțelor, utilizând testele Shapiro-Wilk și, respectiv, Levene. Din cauza încălcării acestor criterii, datele au fost transformate folosind logaritmul sau rădăcina pătrată atunci când a fost necesar. Comparațiile multiple cu diferite ciuperci filamentoase au fost efectuate folosind testul t cu corecția Bonferroni.

Pentru compararea între izolate, suprafața de creștere micelială a L. gongylophorus în contact cu izolatele de Escovopsioides a fost împărțită la suprafața medie a martorului său în ziua 10. Datele au fost verificate în ceea ce privește normalitatea și omogenitatea varianțelor. S-a efectuat o ANOVA cu o singură cale cu suprafața obținută în ziua 10 între toate ciupercile testate, iar comparațiile între diferitele tratamente au fost efectuate cu ajutorul testului post-hoc Tukey-HSD. Analizele statistice au fost efectuate în R v. 2.12.1 .

Analize biologice pe fragmente de grădini de ciuperci în absența lucrătoarelor

Leucoagaricus gongylophorus este cultivat în colonii de furnici atine în grădini de ciuperci. Pentru a determina dacă Escovopsioides se poate dezvolta pe grădina de ciuperci fără posibilele efecte protectoare ale lucrătoarelor, am efectuat bioteste folosind fragmente din acest substrat lipsite de furnici. Fragmentele din grădina de ciuperci au fost obținute de la o colonie matură și sănătoasă de A. sexdens rubropilosa menținută la Centrul pentru studiul insectelor sociale (UNESP, Rio Claro). Fragmentele de grădină de ciuperci de 2 cm3 lipsite de furnici și puiet au fost plasate în cutii Petri sterile cu bumbac umezit pe margini (după Elizondo-Wallace et al. ). Înainte de efectuarea experimentelor, plăcile au fost păstrate timp de 1 zi la 25 °C pentru a căuta furnici care eventual au rămas în fragmente.

Am pregătit o suspensie de 10 ml de 0,05% Tween 80 cu masă micelială și conidii din fiecare dintre cele 12 Escovopsioides (izolatul LESF 591 nu a fost utilizat în acest experiment) și un izolat de Escovopsis utilizat în experimentele de cultură dublă. Această suspensie a fost filtrată de două-trei ori după metoda Newmeyer pentru a separa conidiile de fragmentele de hifă prezente în suspensie. Apoi, suspensia a fost diluată până la 105 până la 2,105 conidii mL-1determinate într-o cameră Neubauer. S-au inoculat alicote de 100 μL de suspensii de conidii pe suprafața fragmentului de grădină cu ajutorul unei micropipete. Aceeași cantitate de soluție sterilă de 0,05% Tween 80 a fost adăugată pe suprafața grădinii ca martor negativ. Farfuriile Petri cu grădina de ciuperci au fost păstrate la 25 °C timp de până la 10 zile, fiind utilizate cinci farfurii pentru fiecare tratament și cinci farfurii pentru fiecare control respectiv. Posibila dezvoltare a hifelor ciupercilor inoculate a fost observată zilnic la un stereomicroscop (EZ4, Leica). Conidierea Escovopsioides pe grădinile de ciuperci a fost observată prin prelevarea unor fragmente de miceliu care creșteau pe grădini și care au fost montate în apă și observate la microscop (DM500, Leica).

Datele privind creșterea și conidierea pe grădinile de ciuperci au fost punctate astfel: nicio creștere (scor 0), creștere observată doar la stereomicroscop (scor 1), creștere macroscopică (scor 2) și conidiere (scor 3) pe parcursul a 10 zile de monitorizare (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Am observat conidierea numai după creșterea macroscopică a ciupercii pe grădinile de ciuperci. Suma totală a scorurilor din cinci vase Petri în fiecare zi a fost obținută și transformată în procente din totalul maxim posibil pentru comparații directe.

Efectele Escovopsioides asupra grădinilor cu lucrătoare

Lucrătoarele au un rol important în apărarea coloniei împotriva agenților patogeni și a microbilor nedoriți în grădinile de ciuperci . Astfel, am efectuat experimente pentru a verifica influența lucrătoarelor în grădinile de ciuperci inoculate cu conidii ale acelorași ciuperci utilizate în biotestele pe grădini de ciuperci în absența lucrătoarelor furnici (12 izolate de Escovopsioides și 1 izolat de Escovopsis).

Biotestele care utilizează colonii de furnici cu regină dreaptă sunt o provocare din cauza numărului mare de colonii pe care le-ar solicita acest tip de experiment. Astfel, am efectuat bioteste cu fragmente de grădini care conțin lucrătoare pentru a evalua efectele izolatelor fungice in vivo. Deși acest montaj experimental nu reprezintă ceea ce se întâmplă în coloniile naturale, a arătat informații orientative cu privire la acțiunea defensivă a lucrătoarelor împotriva ciupercilor testate. Acest biotest a fost adaptat după metoda lui Elizondo-Wallace et al. S-au folosit recipiente din plastic cu un strat mic de ipsos pe fund pentru a evita desecarea grădinilor de ciuperci. În recipientele de plastic au fost plasate aproximativ 20 cm3 de grădină de ciuperci din aceeași colonie utilizată în experimentul anterior. Setul experimental a cuprins un total de 84 de recipiente, astfel încât tratamentele cu conidii ale celor 13 ciuperci și martorul au avut câte șase recipiente fiecare. Am selectat furnici lucrătoare cu diametrul capsulei cefalice între 1,0 și 1,6 mm , apoi 50 dintre aceste lucrătoare au fost plasate în fiecare recipient. Lucrătoarele cu mai puțin de 1,0 mm nu au fost numărate, iar cele cu mai mult de 1,6 mm au fost excluse. Această procedură a fost adoptată pentru a permite omogenitatea între cele șase containere din fiecare tratament, precum și între tratamente, deoarece lucrătorii din intervalul cuprins între 1,0 și 1,6 mm au o activitate de curățare semnificativă . Suprafața interioară a recipientului a fost acoperită cu Teflon® pentru a preveni scăparea furnicilor.

Recipientele au fost incubate la 25 °C timp de 3 zile pentru a stabiliza grădinile de ciuperci. Suspensiile de conidii au fost obținute conform descrierii de mai sus. Un total de 1 ml de suspensie de conidii a fost pulverizat pe suprafața grădinilor de ciuperci cu ajutorul unui pulverizator. Grădinile de ciuperci din martorul negativ au fost pulverizate doar cu 1 ml de soluție sterilă de Tween 80 0,05%.

Experimentele au fost monitorizate după 0, 5 și 10 zile de la inoculare pentru a verifica starea de sănătate a grădinilor de ciuperci. Acest parametru s-a bazat pe un sistem de notare, în care grădinile sănătoase au primit scorul 0, grădinile parțial degradate au primit scorul 1 și grădinile complet degradate („infectate”) au primit scorul 2. Îndepărtarea de către furnici a bucăților de grădini de ciuperci și alocarea acestora la gropile de gunoi a fost principalul semn de deteriorare a grădinilor pe care l-am examinat (a se vedea Fișierul suplimentar 1: Figura S2). Scorurile obținute de cele șase containere din fiecare experiment, în cele 3 zile de observație, au fost comparate cu ajutorul testului Friedman.

Pentru a verifica prezența izolatelor de Escovopsioides pe grădinile de ciuperci în zilele 0, 5 și 10 după tratament, fragmentele au fost îndepărtate din grădini și inoculate pe MA2% suplimentat cu 150 μg mL- 1 de cloramfenicol. Plăcile au fost incubate la 25 °C timp de 7 zile, la întuneric. S-au folosit cinci plăci cu câte un fragment de grădină pentru fiecare dintre cele șase recipiente din fiecare tratament, totalizând 30 de plăci pentru fiecare tratament. Fragmentele cu creștere pozitivă au fost numărate și prezența pe termen lung a ciupercilor inoculate în grădinile de ciuperci a fost testată cu ajutorul testului Fisher’s Exact. În această analiză am comparat proporția de franjuri infectate cu conidii fungice (Escovopsioides și Escovopsis) față de martorul fără conidii în fiecare zi de experiment. De asemenea, am comparat diferitele tratamente cu ciuperci inoculate între ele în fiecare zi de experiment.

.