HypaCas9 și Cas9-HF1 prezintă rate lente de scindare observate

Începem analizele noastre cinetice prin măsurarea concentrației situsului activ al enzimei pentru fiecare dintre variantele Cas923,24,25. Măsurarea cantității de produs format într-o titrare a enzimei cu concentrații din ce în ce mai mari de ADN a evidențiat concentrații ale situsului activ de 31 nM, 26 nM, 23 nM pentru SpCas9, HypaCas9 și, respectiv, Cas9-HF1, pentru eșantioane de enzimă cu o concentrație nominală de 100 nM, pe baza absorbției la 280 nm (Fig. Suplimentară 1a-d). Am măsurat, de asemenea, concentrațiile situsului activ al SpCas9 și HiFiCas925 de la Integrated DNA Technologies (IDT) și am observat concentrații similare de enzimă activă (Fig. Suplimentară 1e-f). Este important de remarcat faptul că, în fiecare caz, concentrația de ADN necesară pentru a satura semnalul a fost egală cu concentrația de produs format, ceea ce elimină îngrijorarea că o parte din enzimă ar putea lega ADN, dar nu reacționa. Toate experimentele ulterioare au fost configurate folosind concentrația de enzimă activă determinată în titrarea situsului activ.

Pentru a compara cinetica substraturilor de ADN pe sau în afara țintei ale SpCas9 cu variantele modificate, am examinat mai întâi evoluția în timp a scindării catenei țintă (HNH) pentru fiecare enzimă (Fig. 1 și Fig. suplimentară 2). Datele au fost ajustate fie cu o funcție mono-exponențială, fie cu o funcție dublu-exponențială folosind Ecuația (1), respectiv Ecuația (2).

unde Y reprezintă concentrația produsului de scindare, A1 reprezintă amplitudinea, iar λ1 reprezintă rata de dezintegrare observată (valoarea proprie)17.

unde Y reprezintă concentrația produsului de scindare, A1 reprezintă amplitudinea și λ1 reprezintă rata observată pentru prima fază. A2 reprezintă amplitudinea și λ2 reprezintă rata observată pentru a doua fază.

Compararea ratelor observate de scădere a scindării substraturilor pe și în afara țintei de către SpCas9 arată că nepotrivirea PAM-distal de 3 bp încetinește enzima de 13 ori (de la 1 s-1 la 0,076 s-1). Ambele variante Cas9 de înaltă fidelitate reduc drastic rata de decădere observată pentru scindarea substraturilor de ADN la țintă de 21 până la 35 de ori în comparație cu SpCas9 (0,028 s-1 pentru HypaCas9 și 0,047 s-1 pentru Cas9-HF1 față de 1 s-1 pentru SpCas9). Mai mult, HypaCas9 și Cas9-HF1 reduc și mai mult ratele de dezintegrare a scindării ADN-ului în afara țintei de 8 până la 290 de ori (rate de 0,0033 s-1 și, respectiv, 0,00016 s-1) în raport cu ratele lor respective cu ADN-ul la țintă. Aceste date demonstrează schimbări dramatice în ratele observate de scindare de către variantele modificate cu ADN pe și în afara țintei. Cu toate acestea, aceste măsurători singure nu definesc modificările în ceea ce privește specificitatea, care este o funcție a împărțirii cinetice a scindării ADN-ului față de disociere, cuprinzând toate etapele care duc la prima etapă ireversibilă din cale17 , inclusiv legarea reversibilă a ADN-ului, formarea buclei R, fixarea domeniului HNH și scindarea ADN-ului.

Dezfășurarea ADN-ului este în mare parte neschimbată în cazul variantelor Cas9

Din moment ce lucrările noastre anterioare au identificat formarea buclei R ca fiind limitarea vitezei pentru clivarea la țintă, iar alții au sugerat ulterior că ratele de formare a buclei R și de reînfășurare pot dicta specificitatea enzimatică pentru SpCas9 și Cas9-HF116, am testat dacă HypaCas9 ar prezenta o cinetică similară. Pentru a măsura în mod direct ratele de formare a buclei R pentru toate enzimele, am utilizat un test cu flux oprit bazat pe măsurarea fluorescenței tCo la -16 nt, un analog de citosină triciclic fluorescent care este stins prin stivuire de baze în ADNdS, astfel încât deschiderea duplexului duce la o creștere mare a fluorescenței. Experimentele noastre de control folosind atât substraturile noastre analogi de baze marcate cu tCo- cât și cu 2-AP la pozițiile -16, -9 și, respectiv, -1 nt (Fig. suplimentară 3), arată că niciunul dintre analogi nu afectează rata de descreștere observată pentru scindarea ADN-ului. Structurile chimice ale tCo și 2AP sunt mult mai puțin voluminoase decât markerii Cy3 și Cy5 mai mari și este mai puțin probabil să interfereze cu cinetica enzimatică (Fig. suplimentară 4). În prezența Mg2+, SpCas9, HypaCas9 și Cas9-HF1 derulează substratul ADN vizat cu rate de dezintegrare aproape identice (~2 s-1) (Fig. 2). În mod surprinzător, rata de dezintegrare a formării buclei R pentru substraturile de ADN în afara țintei pentru toate variantele Cas9 a fost, de asemenea, în mare parte neschimbată (între 0,85 s-1 și 2,59 s-1). Prin urmare, derularea ADN-ului nu este limitatoare de viteză și nu este corelată cu ratele observate de scindare pentru variantele de înaltă fidelitate, spre deosebire de SpCas9.

Ratele de dezintegrare a formării buclelor R au fost măsurate prin monitorizarea creșterii fluorescenței de la tCo (poziția -16 în șirul nețintă) în funcție de timp după amestecarea enzimei (28 nM) cu ADN (10 nM) în prezența a 10 mM Mg2+. Datele au fost ajustate la o funcție exponențială dublă pentru a obține ratele de descreștere prezentate. a, b SpCas9 (28 nm) cu ADN pe țintă (a) și în afara țintei (b), c, d HypaCas9 cu ADN pe țintă (c) și în afara țintei (d). e, f Cas9-HF1 cu ADN pe țintă (e) și în afara țintei (f).

Datorită localizării tCo la -16 nt, este probabil ca măsurătorile noastre să reflecte o etapă târzie în procesul de derulare. Pentru comparație, am măsurat rata de dezintegrare pentru formarea buclei R folosind tCo marcat într-o poziție imediat proximală față de PAM (poziția -1 nt). După ce am amestecat rapid Cas9-RNA cu substratul ADN la țintă, am observat o creștere marcantă a fluorescenței pe măsură ce ADN-ul derulează analogul bazei tCo. Am ajustat datele la o dublă-exponențială pentru a determina rata majoră de dezintegrare de 10 s-1 (Fig. 3a-f). În mod intrigant, aceste rezultate indică faptul că, odată ce un site PAM este angajat cu enzima, derularea inițială a ADN-ului este mai rapidă decât cea observată la -16 nt. Aceste date sugerează că rata netă de decădere a derulării observată la -16 nt poate fi o funcție a mai multor etape rapide de derulare care duc la derularea completă. Cu toate acestea, deoarece nu s-a observat niciun decalaj în cinetică, se pare că etapele mai rapide și mai timpurii de derulare parțială conduc la o etapă finală de limitare a vitezei de derulare completă, măsurată la poziția -16 nt. Deși sunt necesare studii suplimentare pentru a examina efectele nepotrivirilor în etapele anterioare ale derulării, măsurarea noastră actuală oferă cea mai bună estimare a ratei nete de formare a buclei R. Rata de descreștere măsurată pentru formarea buclei R cu ajutorul acestei etichete este nediferențiată atât pentru SpCas9, cât și pentru variantele de înaltă fidelitate pe toate substraturile testate, astfel încât ratele de derulare a ADN-ului par a fi neschimbate de enzimele Cas9 modificate.

Ratele de dezintegrare a formării buclelor R au fost măsurate prin monitorizarea creșterii fluorescenței de la tCo (poziția -1 în șirul nețintă) în funcție de timp după amestecarea enzimei (28 nM) cu ADN (10 nM) în prezența a 10 mM Mg2+. Datele au fost ajustate la o funcție exponențială dublă pentru a obține ratele de descreștere prezentate. a, b SpCas9 (28 nm) cu ADN pe țintă (a) și în afara țintei (b), c, d HypaCas9 cu ADN pe țintă (c) și în afara țintei (d). e, f Cas9-HF1 cu ADN pe țintă (e) și în afara țintei (f). g Desen animat al rearanjării domeniului HNH. h FRETSpCas9 marcat cu perechea Cy3 și Cy5 la C867 și, respectiv, C355, a fost utilizat pentru a măsura mișcarea domeniului HNH în timpul scindării substraturilor pe țintă.

Pentru a corela ratele de formare a buclei R cu etapele implicate în ancorarea domeniului HNH pe filamentul țintă, am măsurat modificarea conformațională a enzimei folosind analiza cu flux oprit pe un Cas9 care a fost marcat cu Cy3 și Cy5, așa cum a fost descris anterior18. Pe scurt, o versiune Cysteine-light a Cas9 a fost marcată cu Cy3 la aminoacidul 355 și Cy5 la aminoacidul 867. Eficiența FRET crește atunci când domeniul HNH se rearanjează la starea activă din punct de vedere catalitic (Fig. 3g). După ce am amestecat rapid Cas9 marcat cu perechi FRET cu un ADN perfect adaptat la țintă, am observat o creștere a eficienței FRET, ceea ce indică faptul că domeniul HNH se rearanjează la o stare activă din punct de vedere catalitic. Am măsurat rata de descreștere pentru andocarea HNH ca fiind de ~2,5 s-1 (Fig. 3h), care este similară măsurătorilor FRET cu o singură moleculă. În mod surprinzător, ratele observate de formare a buclei R (1,5 s-1) și de andocare a domeniului HNH sunt foarte asemănătoare, ceea ce indică faptul că aceste etape pot fi legate din punct de vedere cinetic. Rata de descreștere ușor mai rapidă observată pentru mișcarea domeniului HNH ar putea fi datorată reacției inverse, deoarece mișcarea domeniului ajunge la echilibru după sau coincide cu formarea buclei R.

Ratele de descreștere a derulării ADN-ului au fost, de asemenea, măsurate prin metode cu o singură moleculă, folosind un ADN marcat cu o pereche FRET, Cy3 și Cy5 au fost marcate pe poziția -6 nt a catenei țintă și, respectiv, -16 nt pe catena nețintă16. Prin urmare, am testat, de asemenea, substraturile de ADN cu perechi FRET în încercarea de a corela semnalul FRET cu ratele observate de scindare a ADN-ului. În primul rând, am testat substratul utilizat anterior în studiile cu o singură moleculă fără etichetele Cy3/Cy516, care are o diferență de două nucleotide față de substratul nostru, mai exact, o substituție T la pozițiile -16 și -18. Rata de dezintegrare a clivajului catenei țintă (HNH) este similară cu cea a substratului nostru (0,7 s-1 față de 1 s-1, Fig. suplimentară 5a), astfel încât contextul secvenței în această poziție nu are un efect semnificativ. Am testat, de asemenea, scindarea cu ADN marcat cu Cy3/Cy5 cu această altă secvență, iar aceasta a prezentat o rată de dezintegrare similară cu cea a secvenței noastre (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, figurile suplimentare 5b și 6a). Ulterior, am examinat evoluția în timp a clivajului catenei țintă (HNH) a ADN-ului marcat cu Cy3/Cy5 cu secvența noastră pentru fiecare enzimă (Fig. Suplimentară 6). Cu SpCas9, reacția ADN-ului marcat cu Cy3/Cy5 urmează o singură exponențială cu o rată de descreștere semnificativ redusă (0,06 s-1 față de 1 s-1), ceea ce arată o scădere de ~17 ori a ratei de descreștere observate pentru scindarea ADN-ului în comparație cu substratul neetichetat. HypaCas9 și Cas9-HF1 modificate au prezentat, de asemenea, rate reduse de scindare a ADN-ului de 0,0046 s-1 și, respectiv, 0,0016 s-1, care sunt de 5,9 ori și, respectiv, de 28,75 ori mai lente decât substraturile neetichetate măsurate în condiții identice. Este clar că interferența marcajelor Cy3/Cy5 modifică efectul variantelor de înaltă fidelitate asupra vitezelor de scindare a ADN-ului. Luate împreună, marcarea ADN-ului cu etichete Cy3 și Cy5 voluminoase a avut un impact dramatic asupra enzimei. Din aceste motive, nu au mai fost efectuate alte studii utilizând ADN-ul marcat cu perechi FRET.

Specificitatea Cas9 este guvernată de împărțirea cinetică

Din moment ce specificitatea enzimei este o funcție a tuturor etapelor care conduc la prima etapă în mare parte ireversibilă, trebuie luate în considerare toate evenimentele anterioare clivajului ADN-ului17. Pentru a măsura rata intrinsecă de scindare, am ocolit etapa de formare a buclei R, care în mod normal limitează viteza, prin preincubarea SpCas9 cu ADN în afara țintei în absența Mg2+ pentru a permite ca legarea și modificările conformaționale să ajungă la echilibru pentru a forma un complex SpCas9.ADN. Am inițiat apoi reacția chimică prin adăugarea a 10 mM Mg2+. În studiile noastre anterioare, formarea buclei R a fost limitarea vitezei de reacție a SpCas9 cu ADN-ul țintă, iar rata de decădere a clivajului intrinsec a fost mai rapidă atunci când a fost măsurată cu ajutorul protocolului de preincubare. Aici, cu ADN în afara țintei, ratele de scindare HNH și RuvC au fost măsurate ca fiind de 0,12 s-1 și, respectiv, 0,14 s-1 (Fig. Suplimentară 7c, d și Fig. Suplimentară 8), care sunt mult mai lente decât ratele de formare a buclelor R. În mod intrigant, aceste rezultate arată că etapa de limitare a vitezei în calea enzimatică a SpCas9 cu o țintă externă este scindarea ADN-ului, deoarece rata de dezintegrare pentru formarea buclei R pe care am măsurat-o a fost de 0,85 s-1 (Fig. 2b). Aceste date indică faptul că discriminarea se bazează, cel puțin în parte, pe o schimbare a identității etapei care limitează viteza în compararea ADN-ului cu și fără țintă.

Am repetat aceste experimente cu HypaCas9 și Cas9-HF1 cu ADN cu sau fără țintă. Aceste rezultate definesc ratele observate pentru scindarea HNH de 0,035 s-1 și 0,0023 s-1 pentru HypaCas9 cu substraturi on- și, respectiv, off-target (Fig. suplimentară 7g, k). Ratele de scindare observate pentru Cas9-HF1 pentru substraturile on- și off-target au fost măsurate ca fiind de 0,038 s-1 și, respectiv, 0,00014 s-1 (Fig. suplimentară 7o, q). Aceste rate de scindare observate sunt ceva mai rapide decât cele măsurate cu adăugarea simultană de ADN și Mg2+, ceea ce indică faptul că o altă etapă decât formarea buclei R, dar care precede scindarea ADN-ului, poate încetini rata de dezintegrare observată. Cu toate acestea, aceste rezultate arată că ratele de scindare observate pentru ADN-ul țintă sunt reduse de ~100 de ori atât pentru HypaCas9, cât și pentru Cas9-HF1 în raport cu SpCas9. Pentru ADN-ul în afara țintei, ratele de scindare observate sunt reduse de 50, respectiv 860 de ori pentru HypaCas9 sau Cas9-HF1, în raport cu SpCas9.

Discriminarea nu este definită doar de ratele relative de scindare a ADN-ului. Mai degrabă, deoarece formarea buclei R este rapidă, discriminarea este o funcție a împărțirii cinetice între ratele de eliberare a ADN-ului și cele de scindare17,26,27. Pentru a cuantifica repartiția cinetică, am incubat enzima și ADN-ul marcat în absența Mg2+, care permite formarea buclei R să ajungă la echilibru, dar împiedică cataliza15. Am adăugat apoi Mg2+ pentru a iniția reacția în prezența unui exces mare de ADN identic, neetichetat la țintă, care să servească drept capcană. Comparația dintre experimentele paralele efectuate în prezența și în absența capcanei de ADN oferă o estimare a partiției cinetice fracționate pentru disocierea față de scindarea ADN-ului legat (Fig. 4a). Odată ce SpCas9 a fost legat de ADN-ul țintă, acesta a fost scindat rapid, iar capcana de ADN a avut un efect redus (Fig. 4b). În schimb, 33 % din ADN-ul din afara țintei s-a disociat de enzimă, în timp ce ~67 % din ADN a fost supus clivajului (Fig. 4c și Fig. Suplimentară 9a). Aceste rezultate arată că SpCas9 discriminează ADN-ul nepotrivit PAM-distal prin scăderea ratei de scindare, ceea ce crește fracțiunea de ADN care este eliberată și nu scindată. Cu toate acestea, efectul este mic, astfel încât rata de disociere pare să fie mai lentă decât cea de scindare.

a Schema experimentului de captare a ADN-ului. b, c Scindarea SpCas9 de către SpCas9 a ADN-ului la țintă (de la Gong et al.15) (b) sau în afara țintei (c) ADN. d, e Scindarea HypaCas9 a ADN-ului pe țintă (d) sau în afara țintei (e). f, g Scindarea Cas9-HF1 a ADN-ului pe țintă (f) sau în afara țintei (g). Enzima (28 nM) și ADN marcat (10 nM) au fost incubate în absența Mg2+, iar reacția a fost inițiată prin adăugarea de Mg2+ în prezența sau absența unui exces de capcană de ADN nelalocalizat. A- și A◦ reprezintă amplitudinea cu (cercuri umplute) și, respectiv, fără capcană (cercuri deschise). Procentul indică fracțiunea de ADN prelegat care se angajează să meargă mai departe pentru scindare în raport cu reacția în absența capcanei.

În continuare, am examinat repartiția cinetică pentru HypaCas9 și Cas9-HF1 legate de ADN-ul țintă (Fig. 4d, f, Fig. suplimentară 9b, d). Rezultatele noastre cu HypaCas9 și Cas9-HF1 arată că ~75% și, respectiv, ~92% din ADN-ul pe țintă a fost scindat în prezența capcanei. Procentul scindat este mai mic decât în cazul SpCas9 de tip sălbatic, deoarece rata de descompunere intrinsecă a scindării observată pentru ADN-ul la țintă de către HypaCas9 (0,035 s-1) și Cas9-HF1 (0,038 s-1) a fost de 100 de ori mai lentă decât în cazul SpCas9 (4,3 s-1). Această rată de scindare mai lentă oferă timp pentru ca o mică fracțiune (8 până la 25%) din ADN-ul pe țintă să se disocieze înainte de a fi scindat.

Părțirea cinetică pentru a favoriza disocierea a fost îmbunătățită atunci când HypaCas9 și Cas9-HF1 reacționează cu ADN în afara țintei, deoarece ratele de scindare au fost în continuare reduse la 0,0023 s-1 și, respectiv, 0,00014 s-1 (Fig. 4e, g, Fig. suplimentară 9c, e). Aceste rate sunt de 50 până la 860 de ori mai lente, respectiv, în comparație cu SpCas9 pe un substrat în afara țintei. În consecință, doar ~24 % și ~10 % din ADN-ul legat în afara țintei a fost angajat să meargă mai departe pentru scindare de către HypaCas9 și, respectiv, Cas9-HF1, în prezența ADN-ului capcană. Luate împreună, aceste rezultate arată că variantele de înaltă fidelitate modificate au dobândit o specificitate îmbunătățită împotriva ADN-ului nepotrivit PAM-distal prin scăderea semnificativă a ratei de clivaj, ceea ce modifică repartiția cinetică pentru a favoriza eliberarea mai degrabă decât clivarea substratului legat atât pentru ADN-ul legat, cât și pentru ADN-ul ne-țintă, dar efectul este mai mare pentru ADN-ul ne-țintă. Calcularea constantelor de viteză de disociere aparentă folosind Ecuația (3) arată că variantele de înaltă fidelitate nu cresc rata aparentă de eliberare a ADN-ului (Tabelul suplimentar 1).

În schimb, discriminarea crescută este atribuită în întregime scăderii constantei de viteză aparentă pentru scindare.

În descrierile noastre de până acum ale cineticii enzimelor Cas9, ratele de dezintegrare observate ale reacțiilor au fost estimate pe baza ajustării datelor la funcții exponențiale, care produc valori proprii care sunt de obicei funcții complexe ale mai multor constante de viteză17. Pentru a înțelege pe deplin cinetica și mecanismul, toate experimentele pentru fiecare enzimă și substrat de ADN au fost ajustate la nivel global pe baza integrării numerice a ecuațiilor de rată cu ajutorul unui singur model unificat (Fig. 5 și figurile suplimentare 10-14). Ajustarea globală a datelor arată că modelul nostru minimal (Fig. 5f, inset) explică datele noastre și fiecare dintre constantele de viteză este bine definită pe baza analizei conturului de încredere care testează măsura în care fiecare parametru este constrâns de date (Fig. 6)17,28. Rețineți, în special, că modelul nostru explică urmele bifazice observate în unele experimente fără a fi nevoie să invocăm eterogenitatea și oferă constante de viteză intrinseci pentru fiecare etapă a căii, inclusiv formarea buclei R și evenimentele de scindare HNH și RuvC. Deși este probabil ca rearanjamente structurale suplimentare, nerezolvate, să fie necesare pentru alinierea reziduurilor catalitice pentru scindarea ADN-ului, acestea nu au fost încă rezolvate ca evenimente distincte din punct de vedere cinetic. Modelul actual reprezintă o cale minimă necesară și suficientă pentru a lua în considerare toate datele disponibile și poate fi extins cu ușurință pe măsură ce noi informații devin disponibile pentru a defini etape suplimentare în cale.

a Despicarea inițiată de ADN și Mg2+ de către domeniul HNH. b Despicarea inițiată de ADN și Mg2+ de către domeniul RuvC. c Rata de formare a buclei R. d Despicarea inițiată de Mg2+ de către domeniul HNH. e Despicarea inițiată de Mg2+ de către domeniul RuvC. f Efectul capcanei ADN asupra împărțirii cinetice a despicării Cas9. Toate curbele au fost calculate pe baza ajustării globale a datelor în conformitate cu modelul cinetic (inserați), cu constantele de viteză prezentate în tabelul 1. Estimările erorilor s-au bazat pe analiza conturului de încredere, așa cum se arată în Fig. 6. E este Cas9.gRNA, D este ADN țintă, ED este Cas9.gRNA.ADN, EDH reprezintă formarea buclei R cu fixarea catenei țintă la HNH, EDHR și EDP1R reprezintă formarea buclei R cu fixarea catenei non-țintă la RuvC, EDHP2 reprezintă scindarea RuvC a catenei non-țintă, EDP1 reprezintă scindarea HNH a catenei-țintă, EDP1P2 reprezintă scindarea ambelor catene, Dtrap reprezintă excesul de ADN neetichetat, perfect adaptat. EDtrap este Cas9.gRNA.DNAtrap.

Contururile de încredere sunt prezentate pentru ajustarea datelor din Fig. 5. Constantele de viteză numerotate sunt definite în modelul nostru cinetic (Fig. 5f, inset). Pragul χ2 (linia punctată) a fost setat la 0,99 pentru a defini limitele superioare și inferioare pentru fiecare constantă de viteză, așa cum este descris17,32. Deoarece contururile au fost simetrice cu parametrii bine constrânși, raportăm limitele de eroare ± în Tabelul 1. Pentru această analiză, un prag χ2 a fost calculat folosind o distribuție F și a fost utilizat pentru a defini limitele inferioare și superioare pentru fiecare parametru.

Pentru a înțelege specificitatea enzimei, constantele de viteză trebuie interpretate în contextul tuturor etapelor relevante din punct de vedere cinetic, așa cum este ilustrat în profilul energiei libere (calculat folosind Ec. (4) pornind de la constantele de viteză din tabelul 1).

Coeficientul de transmisie A = 0,001

Pentru că ajustarea globală a datelor furnizează constantele de viteză pentru fiecare etapă relevantă (figurile 5 și 6), putem construi un profil de energie liberă de bună credință (fig. 7b și figurile suplimentare 10-14). Profilurile de energie liberă care compară SpCas9, HypaCas9 și Cas9-HF1 arată o schimbare în etapele de limitare a vitezei și de determinare a specificității. Specificitatea enzimei este definită de kcat/Km și este dată de cea mai mare barieră globală în raport cu starea de plecare, în timp ce rata maximă, kcat, este definită de cea mai mare barieră locală în raport cu starea precedentă, atenuată de orice etape de echilibru rapid anterioare. Deoarece constantele de viteză pentru formarea buclei R nu se schimbă în mod semnificativ cu diferite substraturi și variante ale enzimei, specificitatea este guvernată în mare măsură de împărțirea cinetică a buclei R a Cas9, starea EDH în modelul nostru cinetic (Fig. 5f, inset), fie pentru a merge înainte, ceea ce duce la scindare ireversibilă, fie pentru a se elibera prin reânchiderea ADN-ului și ejectarea din enzimă. Barierele globale mai mari pentru scindare observate în cazul variantelor de înaltă fidelitate cresc probabilitatea de partiționare cinetică pentru a favoriza disocierea ADN-ului (Fig. 6c).

a Reprezentarea în desene animate a căii de reacție a enzimelor Cas9. b Profilurile de energie liberă pentru clivarea SpCas9 a unei ținte (linie gri) de la Gong et al.15 și, respectiv, în afara țintei (linia roșie); clivarea HypaCas9 a unei ținte în afara țintei (linia albastră); și clivarea Cas9-HF1 a unei ținte în afara țintei (linia neagră). Fiecare profil a fost calculat cu ajutorul teoriei stării de tranziție folosind constantele de viteză și de echilibru care au fost derivate din ajustarea globală a fiecărui set de experimente (tabelul 1). Rețineți că barierele mai mari pentru scindarea ADN-ului în raport cu bariera mai mică pentru reacția inversă precedentă cresc probabilitatea de eliberare a ADN-ului. c Graficul cu bare de sinteză pentru k2, k3 și partiția cinetică (P).