În esență, cultura celulară implică distribuirea celulelor într-un mediu artificial (in vitro) care este compus din nutrienții necesari, temperatura, gazele, pH-ul și umiditatea ideale pentru a permite celulelor să crească și să prolifereze.

• In vivo – Atunci când studiulimplică entități biologice vii din organism.

• In vitro – Atunci când studiul este efectuat folosind entități biologice (celule, țesuturi etc.) care au fost izolate din mediul lor biologic natural. De exemplu, țesuturi sau celuleisolate din ficat sau rinichi.

În timp ce bucăți de țesut pot fi puse în cultura adecvată pentru a produce celule care pot fi apoi folosite pentru cultură (cultură explicativă), celulele din țesuturi (țesut moale) pot fi obținute prin reacții enzimatice. Enzime precum tripsina și pronamina sunt folosite pentru a descompune țesutul și a elibera celulele dorite.

Când celulele au fost obținute direct din țesutul organismului/animalului (sau chiar din țesutul vegetal) prin tehnici enzimatice saumecanice, aceste celule sunt denumite celule primare. Cu toate acestea, celulele care continuă să prolifereze pe termen nedefinit (după prima subcultură)în condiții speciale sunt denumite linii celulare.

Aceste celule particulare tind să fi fost trecute pentru o perioadă lungă de timp, ceea ce le face să dobândească trăsături genotipice și fenotipice omogene (similare).

Morfologie

Pe baza aspectului lor, celulele în cultură pot fi clasificate în trei grupe principale:

• Fibroblastice – Aceasta include celule care tind să fie bipolare/multipolare cu forme alungite. Aceste celule sunt atașate de substrat pe măsură ce cresc.

• Epiteliale – Celulele de tip epitelial ating o formă poligonală cu dimensiuni regulate. Deși tind să crească în pete discrete, aceste celule cresc, de asemenea, atașate de substrat.

• Limfoblast – Aceste celule au de obicei o formă sferică și nu se atașează de suprafața substratului. Ca urmare, ele sunt cultivate în suspensie.

* Pentru plăcile solide, se folosesc agenți de solidificare (cum ar fi agar) în cazul în care mediul lichid este folosit cu agar.

Semnificația culturii celulare

Cultura celulară este o tehnică importantă atât în biologia celulară, cât și în biologia moleculară, având în vedere că oferă cea mai bună platformă pentru studierea fiziologiei și biochimiei normale a celulelor. O celulă este unitatea structurală, funcțională și biologică de bază a tuturor ființelor vii.

Pentru a înțelege un organism sau anumite țesuturi, este important să se înțeleagă modul în care funcționează celulele sale. Prin cultura celulară, acest lucru devine posibil mai ales datorită faptului că celulele primare se aseamănă cu celulele parentale din organism/țesut.

Ceea ce se învață despre celulele in vitro este reprezentativ pentru ceea ce se întâmplă cu organismul/țesutul respectiv. Acest lucru face ca cultura celulară să fie semnificativ de importantă pentru dezvoltarea de vaccinuri, depistarea (medicamente etc.) și diagnosticarea anumitor boli/condiții.

Având în vedere că diferite tipuri de celule necesită medii diferite pentru proliferare, există diferite tipuri de medii utilizate pentru cultură, cum ar fi mediile fără ser și mediile care conțin ser, printre altele.

După ce au fost asigurate cerințele corecte, celulele vor crește în număr și pot forma colonii, care pot fi apoi observate și identificate cu ușurință.Cu toate acestea, toate acestea necesită înțelegerea scopului procedurii.

Înțelegând bine ce se urmărește prin procedură, devine mai ușor să se pregătească cultura cu componentele potrivite. Înțelegând ce se urmărește prin procedură, cercetătorul va ști dacă trebuie să pregătească un mediu selectiv (care să permită creșterea unor celule specifice) sau un mediu diferențial (care să permită creșterea diferitelor tipuri de celule).

Cultura celulară primară

Cultura celulară este un proces prin care celulele (animale sau vegetale) sunt îndepărtate din organism și introduse într-un mediu artificial cu condiții favorabile pentru creștere. Acest lucru permite cercetătorilor să studieze și să învețe mai multe despre celule.

Există trei tipuri majore de culturi celulare, care includ:

• Cultura celulară primară
• Cultura celulară secundară și
• Linia celulară

În acest caz, ne vom concentra asupra culturii celulare primare.

Există două tipuri de celule primare:

Celule aderente – Denumite și celule dependente de anturaj, acestea sunt tipul de celule care au nevoie de atașament pentru creștere. Celulele aderente sunt imobile și se obțin din organe precum rinichiul.

Cele de suspensie – Acestea sunt tipul de celule care nu necesită atașament pentru a se dezvolta. Prin urmare, ele sunt, de asemenea, denumite celule independente de ancorare și includ celule precum limfocitele care se găsesc în sistemul sanguin.

În cultura celulară primară, celulele obținute din astfel de țesuturi parentale (țesuturi vii) precum ficatul și rinichiul, sunt introduse în medii adecvate pentru creștere. Odată ce celulele au fost obținute, ele pot fi cultivate sub formă de cultură de explante, suspensie sau monostrat.

* În cultura celulară primară, celulele trebuie să fi fost obținute din țesutul parental/viu. Adică, ele nu provin dintr-un alt proces de cultură.

Înainte de a fi cultivate, celulele sunt mai întâi supuse unui tratament enzimatic pentru disociere. Cu toate acestea, trebuie să fie pentru o perioadă minimă de timp pentru a evita deteriorarea sau uciderea celulelor. Odată obținute celulele individuale, acestea sunt apoi cultivate în mod corespunzător în medii pentru a le permite să crească (să se dividă) și să ajungă la numărul dorit.

Începând, cultura tinde să fie eterogenă, în sensul că este compusă din diferite tipuri de celule obținute din țesut.Deși acest lucru poate fi menținut prin procesul in vitro (într-o cultură într-un mediu adecvat), acest lucru ar fi doar pentru o perioadă limitată de timp.

Prin procesul de transformare, celulele primare pot fi folosite pentru o perioadă lungă de timp, schimbând cultura în timp. Aceste celule sunt denumite linii de celule continue.

Cu toate acestea, celulele primare sunt de obicei preferate față de liniile de celule continue datorită faptului că sunt mai asemănătoare (din punct de vedere fiziologic) cu celulele invivo (celule din țesutul viu). În plus, liniile celulare continuepot suferi anumite modificări (modificări fenotipice și genotipice) care ar duce la discrepanțe în timpul analizei. Ca atare, ele nu pot fi utilizate pentru a determina ce se întâmplă cu celulele in vivo. Din acest motiv sunt preferate celulele primare.

Datorită faptului că celulele primare se aseamănă în mod semnificativ cu celulele obținute din țesuturi vii, acestea sunt importante pentru scopuri de cercetare, deoarece pot fi folosite pentru a studia funcțiile, reglementările metabolice, fiziologia celulară, dezvoltarea, defectele și condițiile care afectează țesutul de interes.

De asemenea, ele sunt utilizate în scopuri cum ar fi producerea de vaccinuri, screening-ul medicamentelor de inginerie genetică, precum și testarea toxicității și diagnosticul prenatal, printre altele.

Medii de cultură celulară

În tehnicile de cultură celulară, celulele (sau țesuturile)sunt prelevate dintr-o plantă sau un animal și introduse într-un mediu nou, artificial, care le poate susține proliferarea (supraviețuirea și creșterea).

Câteva dintre cerințele unui astfel de mediu pentru proliferarea celulelorinclud:

• Un substrat (sursă de nutriție)
• Un interval de temperatură ideal (controlat)
• Mediu de creștere, și
• Ph-ul ideal, printre altele

Aici, ne vom concentra asupra mediului (mediu de cultură celulară)

Deși există diferite tipuri de medii de cultură (pentru diferite tipuri de celule), acestea sunt compuse de obicei din:

• Glucoză
• Aminoacizi
• Vitamine
• Săruri anorganice
• Factori de atașament Etc.

Există două tipuri majore de medii de cultură.Acestea includ:

Mediu natural – Mediile de cultură naturale sunt compuse din fluide biologice care se găsesc în mod natural. Deși acest tip de mediu poate fi utilizat pentru o gamă largă de celule, cel mai mare dezavantaj al său este acela că îi pot lipsi componentele exacte cerute de anumite celule, ceea ce poate afecta foarte mult reproductibilitatea.

Mediu artificial – Denumit și mediu sintetic, mediul artificial se referă la tipul de mediu care este produs prin adăugarea de nutrienți precum vitamine, gaze (oxigen și dioxid de carbon) și proteine, printre altele. Acești nutrienți organici și anorganici sunt adăugați astfel încât să satisfacă nevoile specifice ale celulelor date și, astfel, să ofere mediul ideal pentru creșterea lor.

Ca atare, ele pot fi folosite pentru o serie de scopuri, inclusiv:

• Asigurarea supraviețuirii imediate a celulelor
• Permiterea unei supraviețuiri prelungite a celulelor
• Permiterea unei creșteri nedeterminate a celulelor
• Asigurarea unor funcții specializate

Pe de altă parte, cultura poate fi clasificată ca:

Mediu selectiv- Acesta este un tip special de mediu care permite doar creșterea anumitor celule. De exemplu, agarul de sânge (utilizat pentru a izola Streptococcus & specia Moraxella) poate fi transformat în mediu selectiv prin adăugarea de antibiotice.

Mediu diferențial- Acest tip de mediu permite creșterea diferitelor tipuri de celule/microorganisme în funcție de metabolismul lor.

După cum s-a menționat mai sus, diferite tipuri de medii sintetice sunt pregătite în așa fel încât să ofere mediul ideal de proliferare pentru anumite celule. Din acest motiv, mediile sintetice pot fi împărțite în patru categorii majore.

Acestea includ:

Mediile care conțin ser – În aceste tipuri de medii, serul (ser fetal bovin) este folosit ca suport pentru nutrienți și factori de creștere, printre altele, care tind să fie insolubile în apă.

Mediu fără ser – Aceste tipuri de medii sunt produse, de obicei, în scopul susținerii unui singur tip de cultură celulară.Ca atare, furnizează nutrienți specifici și alți factori necesari tipului de celulă. În aceste medii, serul este absent deoarece prezintă unele dezavantaje și poate duce la interpretarea eronată a rezultatelor imunologice.

Mediu definit chimic – După cum sugerează și numele, acest tip de mediu este compus din ingrediente organice și anorganice pure, lipsite de contaminare. Constituenții acestui tip de mediu sunt de obiceiproduși prin inginerie genetică în bacterii/levănțică.

Mediu fără proteine – Mediile fără proteine sunt de obicei lipsite de orice tip de proteine. Este utilizat în mare parte pentru a promova o creștere superioară a celulelor, precum și expresia proteinelor, în plus față de a facilita purificarea oricărui produs exprimat.

Câteva dintre componentele majore ale mediilor de cultură celulară includ:

• Nutrienți – asigurați de peptide și aminoacizi, care sunt elementele constitutive ale proteinelor
• Carbohidrați pentru energie
• Minerale esențiale, cum ar fi calciu, magneziu, fosfați și fier, printre altele agenți tampon cum ar fi acetați pentru a stabiliza mediile de cultură
• Vitamine
• Indicatori de modificare a pH-ului, cum ar fi roșu de fenol

Mediile de cultură celulară sunt folosite pentru proliferarea celulelor, care pot fi apoi identificate și studiate. Ca atare, pot fi folosite în diverse scopuri, inclusiv pentru educație, diagnosticare și tratament al unei boli, printre altele.

Suspensie celulară

În metodele de cultură, suspensia celulară se referă la un tip de cultură în care celulele sunt suspendate într-un mediu lichid.

Pentru a obține celule unice, un calus friabil (țesut mic care se destramă ușor) se pune într-un mediu lichid agitat (agitația permite schimbul de gaze, spre deosebire de mediul solid), care se sparge. Acest lucru permite eliberarea celulelor unice, care sunt apoi transferate într-un alt mediu proaspăt.

Culturile în suspensie celulară au un mare avantaj față de cele staționare dat fiind faptul că permit ca celulele să fie scăldate uniform. Mai mult, având în vedere că mediul tinde să fie agitat, permite aerisirea mediului,asigurând gazele pentru celule. Având în vedere că mediul este o suspensie, devine, de asemenea, ușor de manipulat conținutul culturii.

Ca orice altă cultură, cultura de celule în suspensie trebuie să fie în condiții controlate, asigurând celulelor un mediu ideal pentru a prolifera. Odată ce acestea ajung la aproximativ 80 la sută confluență, este momentul subculturii pentru a asigura o creștere continuă și adecvată.

* Confluența de 80 la sută se referă la starea în care80 la sută din suprafața culturii este acoperită de celulele în creștere.

În unele cazuri, celulele în suspensie potadera pe suprafața de plastic a balonului de cultură sau chiar pot forma aglomerări. În astfel de cazuri, se poate folosi o pipetă pentru a culege aceste celule și a le expulza pe suprafața balonului și, prin urmare, departe de suprafața de plastic. Acest lucru ajută la obținerea de celule individuale, având în vedere că acestea nu aderă la suprafața de plastic.

Suspensie de globule roșii

• (stânga: fără hemoliză) suspensie de globule roșii (0,5% globule roșii de oaie în soluție salină), pare roșie și opacă.
• (mijloc: fără hemoliză) Globulele roșii au sedimentat spontan timp de 60 min. Observați că supernatantul nu este colorat.
• (dreapta: hemoliză) Suspensia de hematii tratate cu hemolizină de S. pyogenes la 37C timp de 30 min, devin transparente prin hemoliză.

Vezi mai multe despre globulele roșii

Numărarea celulelor

Contorirea numărului de celule dintr-o suspensie esteun proces care implică utilizarea unui colorant. De exemplu, atunci când se utilizează albastru de tripan, acesta pătrunde în membrana celulară a celulelor moarte, dar nu și în cea a celulelor vii.

Celele sunt apoi expulzate ușor într-un hemocitometru (conține camera de numărare) sub capacul de acoperire și sunt observate la microscop. Celulele sunt apoi numărate într-un anumit număr de pătrate pentru calcule.

Semnificație

Această metodă este în mare parte preferată datorită faptului că permite ca celulele să fie suspendate într-o soluție mai degrabă decât să fie ținute într-un mediu solid. Aici, prin urmare, devine mai ușor de manipulat conținutul, împiedicându-le astfel să formeze clustere. În cazul suspensiilor celulare, este de asemenea mai ușor să se observe celulele individuale la microscop.

În acest caz, devine posibil nu numai să se studieze structura celulelor, ci și să se observe cât de bine s-au diferențiat; vizualizarea la microscop a celulelor moarte și a celor vii.

Protocol de cultură celulară

Protocoalele de cultură celulară sunt menite să asigure că procedurile de cultură sunt efectuate la standardele necesare. Acest lucru nu este menit doar să prevină contaminarea celulelor, ci și să asigure că cercetătorii înșiși sunt protejați de orice formă de contaminare.

În plus, se așteaptă ca natura activității să fie conformă cu liniile directoare etice corespunzătoare. Prin urmare, înainte de orice altceva, este esențial să se asigure că întreaga procedură este conformă atât cu liniile directoare medicale-etice, cât și cu cele privind experimentele pe animale. Acest lucru se datorează faptului că nerespectarea unei astfel de legislații și orientări poate duce la sancțiuni grele și chiar la închiderea laboratorului.

Înainte de începerea oricărei lucrări, efectuați următoarea procedură:

• Asigurați-vă că spațiul de lucru este dezinfectat (folosind etanol 70 la sută)
• Utilizați întotdeauna o pereche nouă de mănuși. Dacă o pereche de mănuși trebuie să fie folosită pentru o altă procedură de cultură celulară,acestea trebuie să fie dezinfectate folosind etanol 70 la sută și lăsate să se usuce la aer.
• Toate echipamentele care au fost scoase din cabinet trebuie, de asemenea, dezinfectate pentru a preveni orice contaminare
• Echipamentele precum pipeta, borcanele de sticlă și materialele plastice care vor fi folosite pentru procedură trebuie să fie autoclavate

Deși există o gamă largă de medii de cultură pentru celule, este important să se țină cont de faptul că culturile de celule, în special culturile de celule primare, sunt ușor predispuse la contaminare, pe lângă riscul de a conține viruși nedetectați. Din acest motiv, toate materialele trebuie manipulate ca fiind potențial infecțioase, pentru a evita orice infecții.

În plus, din motive de siguranță, lucrările asupra culturilor celulare trebuie efectuate în hota cu flux laminar adecvată, unde aerul este direcționat departe de cercetător.

Protocoale de pregătire a culturilor celulare

Verificați întotdeauna informațiile de pe recipient pentru a vă asigura că mediul este adecvat pentru celula care urmează să fie cultivată,

După ce este pregătit, cultura de celule trebuie menținută în intervalul de temperatură recomandat,

Supravegheați cultura la fiecare 30- 48 de ore și verificați gradul de confluență (atunci când celulele acoperă complet suprafața culturii) – Totuși, acest lucru depinde în mare măsură de tipul de celule.

După ce procedura este finalizată și celulele au fost analizate, cultura trebuie eliminată în mod corespunzător. Aici, este important să fim foarte precauți, având în vedere că, în acest moment, celulele au proliferat deja și au crescut în număr. În plus, există șanse mari ca specimenul să fi fost contaminat, ceea ce crește riscurile de a provoca infecții cercetătorului dacă nu este manipulat corespunzător.

Eliminare

• Pentru articole precum bisturie, lame de sticlă și lamele de acoperire, printre altele, de- contaminare poate implica autoclavarea la 121 grade Celsius și 15 psi (presiune) timp de cel puțin 30 de minute. Cu toate acestea, dacă urmează să fie aruncate, este important ca acestea să fie puse într-o pungă de plastic și în containerul corespunzător pentru a fi incinerate ulterior.
• În cazul deșeurilor lichide, dezinfecția chimică este una dintre cele mai bune metode prin care se poate dezinfecta produsul rezidual. Produse chimice cum ar fi înălbitorul pot fi folosite în acest scop înaintede a turna lichidul în scurgerea chiuvetei.
• Pentru deșeurile solide,acestea sunt colectate într-un sac de plastic pentru incinerare. Pe de altă parte, acestea pot fi mai întâi autoclavate înainte de a fi incinerate.

Concluzie

În general, cultura celulară, fie că implicăutilizarea unei suspensii sau a unui mediu staționar, presupune creșterea celulelor într-un mediuartificial cu condiții favorabile. În timp ce acțiunea enzimatică poate fi utilizată pentru a obține celule pentru cultură, metoda de dezagregare mecanică este cea mai preferată, având în vedere că oferă o modalitate mai simplă și mai puțin traumatizantă de obținere a celulelor.

Această metodă implică pur și simplu tăierea unui țesut în bucăți mai mici din care se colectează apoi celulele deversate. De asemenea, tehnica explantelor primare poate fi utilizată pentru obținerea celulelor. Cu toate acestea, această metodă este utilă mai ales pentru dezagregarea unor cantități mai mici de țesut.

În timp ce orice celule pot fi folosite în culturi pentru a le observa comportamentul, țesuturile embrionare sunt preferate (pentru celulele primare) în comparație cu celulele adulte, deoarece acestea oferă celule care sunt mai viabile și care pot prolifera rapid.

Aici este, de asemenea, important să se asigure că celulele sunt în cantitate mai mare, având în vedere că rata lor de supraviețuire tinde să fie mai mică în comparație cu subculturile. I

Pentru a spori succesul culturilor, este important, de asemenea, să se asigure că deteriorarea celulelor este redusă la minimum atât în timpulcolectării cât și al procesării celulelor. Acest lucru se adaugă la utilizarea unui mediu adecvat pentru celulele în cauză.

În aceeași ordine de idei, aruncați o privire asupra tipurilor și tehnicilor de cultivare a țesuturilor.

Consultați selecțiile MicroscopeMaster pentru accesorii pentru microscop.

Ca și informații despre diviziunea celulară, diferențierea celulară și colorarea celulelor și obțineți câteva informații despre teoria celulară.

Pentru cei mai avansați și o lectură excelentă este Biologia moleculară a celulei. Precum și învățarea despre Citochimie.

Poate că sunteți student, profesor sau pasionat și doriți să urmăriți informațiile MicroscopeMaster despre experimentele distractive la microscop.

Vezi și Cultura Microscopică și Testarea sensibilității

Întoarceți-vă de la Cultura Celulară la Pagina principală de Biologie Celulară

Întoarceți-vă de la Cultura Celulară la MicroscopeMaster Home

.