3 Inhibitori ai amilazei

α-amilază (1,4-α-d-glucan-glucanohidrolază, EC3.2.1.1) este o endoglucanază care catalizează hidroliza legăturilor endo α-(1,4) glicozidice din amidon și polizaharidele înrudite. Hidroliza amidonului este catalizată mai întâi de α-amilaza prezentă în saliva umană, urmată de amilaza pancreatică din duodenum. α-amilaza pancreatică umană (HPA) este o țintă farmacologică importantă pentru tratamentul diabetului de tip 2. Cu toate acestea, costul HPA este relativ ridicat în scopuri de cercetare. În schimb, α-amilaza pancreasului porcin (PPA) este utilizată pentru măsurarea digestiei in vitro. PPA este compusă din 496 de reziduuri de aminoacizi și prezintă o identitate de 83% cu omologul său uman HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA este o amilază de tip endo și catalizează hidroliza legăturilor glicozidice interne α-(1,4) din amiloză și amilopectină prin atac multiplu spre capătul nereducător (Robyt & French, 1970). Produșii de hidroliză ai α-amilazei pancreatice porcine sunt în principal maltoză, maltotrioză și maltotetraoză (Yook & Robyt, 2002). PPA are doi izomeri PPA izoenzima-I (PPA-I) și PPA-II, care au aceeași greutate moleculară, dar diferă ușor în ceea ce privește compoziția aminoacizilor și punctul izoelectric (Pasero et al., 1986).

Inhibitorii naturali ai α-amilazei includ cei pe bază de proteine și metaboliții secundari. Primii ies din sfera de aplicare a acestui articol deoarece tind să se denatureze în urma unui tratament termic sau acid (aciditatea stomacului) și își pierd activitatea când ajung în intestinul subțire. În cele ce urmează, rezumăm cele mai recente literaturi privind inhibitorii de α-amilază. Sunt enumerate, de asemenea, metodele utilizate în măsurarea activității lor de inhibiție, deoarece metode diferite pot duce la valori IC50 diferite. În comparație cu α-glucozidaza, în cazul α-amilazei se găsesc mai puține rapoarte, iar majoritatea studiilor se referă la polifenoli.

Isookanina (57) (Fig. 3.8) izolată din acele spaniole, Bidens bipinnata, a prezentat o activitate moderată de inhibare a HPA (IC50 de 0,447 mg/mL sau 156 μM), măsurată cu ajutorul testului iodometric (Yang et al., 2012). Trebuie remarcat faptul că izookanina conține două unități catecolice și, prin urmare, este de așteptat să fie un bun reductor, ceea ce ar putea reduce iodul cauzând rezultate fals pozitive.

Figura 3.8. Structuri chimice pentru inhibitorii amilazei, compușii 57-59, acidul 5-caffeoil chinic și acidul 4,5-dicaffeoil chinic.

Din frunza de apă de aplică (Syzygium aqueum), miricetin-3-O-rhamnoside (9) și europetin-3-O-rhamnoside (10) (Fig. 3.2) au fost izolate, iar activitatea de inhibare a inhibiției α-amilazei a fost măsurată cu ajutorul testului DNSA, fiind de 10 ori (EC50 de ~ 2,0 μM) mai puternică decât acarboza (EC50 de 19 μM). O astfel de activitate ridicată este destul de rar întâlnită la compușii polifenolici și justifică investigații suplimentare, în special în ceea ce privește mecanismul său de inhibiție și selectivitatea atunci când acești compuși sunt provocați cu o matrice alimentară complexă. Miricetina este un puternic captator de radicali și, prin urmare, stabilitatea lui 9 și 10 este, de asemenea, un motiv de îngrijorare. Autorii au raportat că quercetina a avut o EC50 comparabilă (17 μM) cu cea a acarbozei (19 μM). Utilizând testul de turbiditate pe care l-am dezvoltat în laboratorul nostru, nu am putut detecta nicio activitate de inhibiție a quercetinei împotriva α-amilazei pancreatice, folosind acarboza ca standard de referință (Huang et al., rezultate nepublicate). Prin urmare, este necesar să se verifice dacă EC50 raportată este dependentă de metodă pentru a exclude un potențial artefact (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus aparține, de asemenea, familiei Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi și Lu (2012) au izolat și purificat 2′4′′-dihidroxi-6′-metoxi-3′5′-dimetilchalcona (DMC) din mugurii florali uscați de C. operculatus. Compusul a prezentat un mecanism inhibitor necompetitiv față de PPA (Hu et al., 2012).

Tilirosida (58) (Fig. 3.8), izolată din semințele de trandafir de câine, Rosa canina L., inhibă PPA cu IC50 de 280 mM, iar studiul cinetic arată că este un inhibitor necompetitiv cu valori Ki de 84,2 μM, cuantificate folosind p-nitrofenil-alfa-d-pentaglucozidă ca substrat. Spre deosebire de acarboză, tilirosida nu prezintă nicio activitate de inhibiție împotriva α-glucozidazei. Poate din cauza activității sale slabe de inhibare a α-amilazei în modelul animal, este necesară o doză mare de tilirosidă (600 mg/kg) pentru a reduce concentrația plasmatică postprandială de glucoză la șoarecii tratați cu amidon la 2 g/kg. Tilirosida poate prezenta antihiperglicemie prin inhibarea absorbției de glucoză mediată atât de transportatorul de glucoză dependent de sodiu 1, cât și de transportatorul de glucoză 2, în enterocite (Goto et al., 2012).

Curcumina și derivații săi au fost sugerate ca fiind compuși cu ținte multiple care au o gamă foarte largă de beneficii pentru sănătate. Ca agent potențial pentru atenuarea vitezei de digestie a amidonului, bisdemetoxicurcumina (59) (Fig. 3.8) din rizomul de Curcuma longa are activitate de inhibare a HPA și PPA cu valori IC50 de aproximativ 25 μM utilizând testul DNSA. Studiul cinetic arată că este un inhibitor necompetitiv al HPA cu un Ki aparent de 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Acizii cafeoilchinici mono- și disubstituiți sunt principalii compuși polifenolici care se găsesc în boabele de cafea verde. Datorită prezenței a trei grupe hidroxil secundare în inelul acidului chinic, există trei izomeri de poziție inter-convertori ai acizilor cafeoilchinici monosubstituiți și trei acizi dicaffeoilchinici, care au fost purificați din boabe de cafea verde. Activitatea lor de inhibare a PPA-I (Narita & Inouye, 2011) a fost măsurată cu ajutorul p-nitrofenil-diglucosidei, care produce p-nitrofenol și maltoză la hidroliză. Este remarcabil faptul că activitatea inhibitorie depinde în mare măsură de poziția grupărilor cafeoil în acidul monocafeoilchinic. Acidul 5-Caffeoilchinic (sau cunoscut în mod obișnuit sub denumirea de acid clorogenic) (Fig. 3.8) are cea mai mare activitate de inhibiție, cu o CI50 de 80 μM, în comparație cu cea a acidului 4-caffeoilchinic (120 μM) și a acidului 3-caffeoilchinic (230 μM). Pentru cei trei izomeri ai acidului dicaffeoil chinic, activitatea inhibitoare este mult mai mare și nu sunt la fel de sensibili la poziția grupărilor ester, deoarece acizii 3,4- și 4,5dicaffeoil chinic (Fig. 3.8) au aceleași valori IC50 (20 mM), iar acidul 4,5dicaffeoil chinic are o IC50 de 30 μM (Narita & Inouye, 2011).