La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es un método para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas muy utilizado por la industria farmacéutica y biotecnológica. El principio bioquímico de la prueba se basa en la reacción de coagulación de la hemolinfa del Limulus polyphemus, comúnmente conocido como cangrejo de herradura del Atlántico, en presencia de antígenos con superficie microbiana, como los lipopolisacáridos o las endotoxinas bacterianas.

La empresa «Wako Chemicals» se encuentra entre las empresas que fabrican reactivos de LAL a nivel internacional debido a su fórmula única de un reactivo de LAL específico para endotoxinas bacterianas sin la interferencia de beta glucanos en las muestras, gracias a la adición de Curdlan carboximetílico (CMC) coliofilizado con LAL. Bajo la marca PYROSTAR™, esta empresa distribuidora de reactivos de investigación fabrica y comercializa reactivos y accesorios de LAL que cumplen con todas las normas, regulaciones y estándares de calidad establecidos por la FDA de EEUU.

Ahora vamos a hablar de los diferentes reactivos y accesorios con los que Wako contribuye al estudio de las endotoxinas bacterianas:

En primer lugar, tenemos el kit Limulus PS Simple Test, que permite la detección y cuantificación de endotoxinas sin la interferencia de otras sustancias coexistentes con el uso de un adsorbente de afinidad para endotoxinas llamado Pyrosep™. Con este método, podemos medir la endotoxina en una muestra lipofílica siempre que pueda disolverse en etanol, como las vitaminas liposolubles, los aceites y grasas, las albúminas, etc. que normalmente no pueden medirse con una prueba de Limulus convencional. Además, no se desperdicia ningún reactivo de LAL, ya que se aplica individualmente en viales de la prueba simple y puede utilizarse en la cantidad exacta necesaria para la medición.

La serie PYROSTAR™ ES-F es una formulación única que contiene Curdlan carboximetílico (CMC) coliofilizado con LAL con el objetivo de eliminar la interferencia con los β-glucanos. El tampón ES desarrollado por Wako contiene altas concentraciones de CMC, convirtiéndose en un reactivo de LAL específico para endotoxinas. Este reactivo está diseñado para ser utilizado tanto en la detección cualitativa de endotoxinas a través del método de coágulos de gel como para su detección cuantitativa a través de los métodos turbidimétricos cinéticos (KTA). Para medir la velocidad del cambio de turbidez se utiliza un instrumento fotométrico llamado Toxinometer®, desarrollado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Los kits PYROSTAR™ ES-F están disponibles con y sin la Endotoxina de Control Estándar (SCE): un reactivo liofilizado refinado a partir de E.coli y utilizado para confirmar la sensibilidad del reactivo LAL, validar los métodos de ensayo del producto y preparar controles de inhibición.

Para apoyar estos reactivos, Wako también está desarrollando una Solución Extractora de Endotoxinas capaz de extraer las endotoxinas de las superficies donde no se pueden extraer con agua o sal. Se recomienda su uso en muestras de endotoxinas en equipos y dispositivos que puedan estar en contacto con líquidos que contengan sangre o proteínas.

Toxinometer® ET-6000 es un lector computarizado de incubación cinética que puede incorporar 3 métodos de ensayo: gel-clot, KTA y KCA (ensayo cinético cromogénico). Este equipo permite obtener resultados de gel-clot y KTA a partir de la misma muestra. Mide simultáneamente hasta 16 muestras con un riesgo de contaminación mucho menor que la microplaca y nos permite archivar las curvas estándar. Toximaster® QC7 es el software que proporciona todas las funciones para el procesamiento de datos y la preparación de informes para el ensayo de LAL con el Toxinometer® ET-6000.

Además, entre los accesorios de los catálogos de LAL de Wako, también vemos tubos de ensayo con y sin tapa de aluminio. Estos tubos se fabrican sin endotoxinas, son de vidrio de borosilicato y están diseñados para el método de coagulación en gel. El grosor del vidrio puede calibrarse específicamente con el Toxinómetro para obtener una intensidad de luz y una transmitancia estables.

Otro reactivo LAL comercializado por Wako es el kit KY Color Limulus. Este reactivo ha sido diseñado para el método KCA y puede utilizarse tanto en el lector cinético como en un lector de microplacas. Incluye un kit multiprueba y un kit de prueba simple, cada uno diseñado para un análisis colorimétrico basado en el tiempo, utilizando un sustrato sintético que genera un color amarillo y que puede detectar específicamente la endotoxina con alta sensibilidad.

Bibliografía:

1) Iwanaga, S. Principio bioquímico de la prueba de Limulus para detectar endotoxinas bacterianas. Actas de la Academia de Japón, Serie B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Extracto 44 (1994), 21ª Reunión Anual de la Sociedad de Agentes Antibacterianos y Antifúngicos.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discriminación entre endotoxina y (1-3) beta-D-glucano utilizando un ensayo cinético turbidimétrico con lisado de amebocitos de Limulus. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

Línea de productos LAL

Kit de reactivos LAL	Accesorios LAL

.