DR. EDWIN B. ASTWOOD foi um visionário na endocrinologia moderna. A Memória Biográfica de Roy Greep e Monte Greer terminou “Além de suas contribuições específicas de pesquisa, o Dr. Edwin B. Astwood foi bem sucedido em uma extensão alcançada por poucos em abranger a ampla área entre Ciências Naturais e medicina clínica”. Para mim, esta é a maior vocação em endocrinologia.

O final dos anos 60 e início dos anos 70 foram marcados pelos incríveis feitos de dois grupos, os dos Drs. Andrew Schally e Roger Guillemin, que isolaram, caracterizaram e sequenciaram os hormônios regulatórios hipotalâmicos. O primeiro hormônio regulador hipotalâmico a ser sequenciado foi o TRH (um tripeptídeo), o segundo foi o hormônio liberador de gonadotropina (um decapeptídeo), e o terceiro foi a somatostatina com 14 aminoácidos. A existência do GHRH havia sido sugerida no início dos anos 60 por algumas experiências clássicas de Reichlin (1); ele fez lesões no hipotálamo e demonstrou que o conteúdo de GH na hipófise declinou. Com base nestes dados, ele sugeriu que deve haver um GHRH no hipotálamo.

Fiz meu treinamento médico em Londres, Inglaterra, com meu treinamento endócrino sob o Prof. G. Michael Besser. Uma das conferências mais agradáveis em que participamos regularmente foi a apresentação de casos clínicos na Royal Society of Medicine. Na minha mente estava escrito que cada vez que um paciente com acromegalia era apresentado, o Prof. Peter Sonksen perguntava se o paciente tinha ou não alguma evidência de um tumor carcinoide. A percepção na audiência era “Por que este homem está sempre fazendo esta pergunta?” porque tais casos provavelmente não existem ou, se existem, muito raramente!

Em 1977, mudei-me do St. Bartholomew’s Hospital (Londres, Inglaterra) para a Universidade da Virgínia. Meu principal interesse naquela época eram os tumores pituitários secretores de PRL e seu tratamento médico.

Em outubro de 1980, uma paciente de 21 anos foi-me encaminhada pela Dra. Ann Johanson. Esta paciente tinha amenorréia e galactorréia enquanto tomava um contraceptivo oral para substituição do esteróide gonadal. Ela tinha agenesia gonadal da síndrome de Turner.

A sua avaliação revelou uma fossa pituitária aumentada na radiografia do crânio, uma massa pituitária com modesta extensão supra-selar na tomografia computadorizada e um PRL sérico elevado de 68 μg/L. Seu GH sérico elevado de 95 μg/L não foi suprimido com glicose oral, aumentado com TRH, e suprimido com uma infusão de dopamina. Seu fator de crescimento sérico semelhante ao da insulina (IGF)-I foi elevado em 11 U/mL (normal, 0,41-2,2 U/mL).

Baseado nestes resultados, o diagnóstico de acromegalia foi claro. É de interesse que a altura do paciente tenha sido de 1,5 m, o que é muito alto para um paciente com síndrome de Turner. Neste sentido, foi uma sorte que os soros tinham sido salvos dos 7 anos anteriores. As concentrações séricas de GH tinham sido elevadas ao longo desse período (Tabela 1).

A paciente foi encaminhada para cirurgia transesfenoidal, a qual foi realizada em 15 de janeiro de 1981. Sete semanas de pós-operatório, foi demonstrado que ela ainda tinha acromegalia; o GH sérico era de 52 μg/L, e o IGF-I ainda estava elevado em 7,7 U/mL.

Como parte de uma colaboração contínua, os espécimes de patologia pituitária foram enviados ao Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Canadá). Algum tempo depois, o Dr. Kovacs ligou-me para me dar os resultados do seu exame do tecido. Seu relatório indicou que este paciente tinha hiperplasia somatotrofia e não um tumor na hipófise. As razões que levaram a este diagnóstico foram: 1) o padrão de reticulina foi preservado (é destruído em tumores) (Fig. 1); 2) os somatotrofos predominaram, embora tireótrofos, gonadotrofos e corticotrofos tenham sido intercalados; e 3) a microscopia eletrônica dos somatotrofos revelou retículo endoplasmático bem desenvolvido e aparelho de Golgi, sugestivo de síntese hormonal ativa (Fig. 2). Como os somatotrofos estavam densamente recheados com grânulos secretores, isto me sugeriu que isto refletia a inibição da liberação hormonal devido à realimentação do GH secretado, presumivelmente pelo aumento da secreção de somatostatina (e/ou IGF-I).

Baseado na histologia da hipófise, ficou claro que a hipófise estava sendo estimulada por um fator extrínseco. Era improvável que isto se devesse a uma mutação no receptor GHRH ou a uma ativação constitutiva da proteína G acoplada ao receptor GHRH, pois isto provavelmente ocorreria em uma única célula, levando ao desenvolvimento tumoral e à quebra do padrão de reticulina. Portanto, era muito mais provável que a pituitária estivesse sendo estimulada por um fator extrínseco, seja GHRH proveniente do hipotálamo ou da periferia. Em segundo lugar, a acromegalia persistente tornou imperativo que encontrássemos a causa da acromegalia deste paciente. Neste momento, um artigo de Frohman et al. (2) relatou a purificação e caracterização parcial de um peptídeo com atividade libertadora de GH de tumores extrapituitários de pacientes acromegálicos.

Uma tomografia computadorizada abdominal demonstrou um tumor de 5 cm de diâmetro na cauda do pâncreas. Em 26 de agosto de 1981, o tumor foi removido. Foi bem encapsulado e na histologia foi determinado que era um tumor de células de ilhotas. No entanto, o tumor não era um tumor de células β ou α. Foi fortemente positivo para enolase específica do neurônio, e na imuno-coloração foi negativo para GH, insulina, glucagon, calcitonina e ACTH, com coloração equívoca para somatostatina.

O tumor não continha GH por imunocitoquímica. Nas primeiras 2 h após a remoção do tumor houve uma rápida queda nos níveis séricos de GH de 70 μg/L para 3 μg/L (Fig. 3) (3). A paciente foi seguida durante 18 anos e permanece curada da acromegalia.

A próxima pergunta foi o que fazer com o tumor pancreático. Naquela época eu tive a sorte de ter o falecido Dr. Michael Cronin como colega na Universidade da Virgínia. Michael veio comigo à sala de cirurgia para ajudar a implementar a nossa estratégia cuidadosamente elaborada para lidar com o tumor. Metade do tumor foi cortada em cubos e imediatamente colocada em nitrogênio líquido, e a outra metade foi preparada para a cultura de tecidos. Esta última foi enviada a vários grupos que eram especialistas em estabelecer linhas celulares estáveis. Michael Cronin conseguiu demonstrar que o meio que banhava este tumor continha GHRH e estimulava a adenilato ciclase (4). O tumor foi inicialmente fornecido ao Dr. Wylie Vale no Salk Institute (La Jolla, CA), e posteriormente ele deu uma parte do mesmo ao Dr. Guillemin. Os dois grupos independentemente descobriram que continha alta atividade de GHRH e foram capazes de isolar o GHRH do tumor, caracterizá-lo e sequenciá-lo (5-8). O GHRH deste tumor era um peptídeo de 40 aminoácidos, que tem homologia com membros da família dos peptídeos glucagon/secretin/VIP.

Eu escolhi a endocrinologia como minha especialidade porque meus mentores me impressionaram com a importância da aplicação da fisiologia para o entendimento da fisiopatologia e terapia de pacientes com doença endócrina.

Cada paciente que se vê é uma experiência da natureza. Tive muita sorte em ser encaminhado este paciente que me permitiu, a mim e aos meus colegas, fornecer o tumor a dois grupos principais que foram então capazes de isolar, caracterizar e sequenciar o GHRH há muito procurado. Na verdade, o GHRH foi um dos primeiros hormônios hipotalâmicos a ser procurado, mas houve muitos inícios falsos.

Existiram várias razões pelas quais foi possível, em 1982, caracterizar e sequenciar com sucesso o GHRH. Primeiro, os métodos para avaliar a actividade dos extractos tumorais tinham sido refinados e eram muito mais sensíveis. Segundo, os métodos de micro-equenciamento foram muito melhorados em relação aos 10 anos anteriores. Mas o terceiro, e provavelmente o mais importante, foi que este tumor continha altas concentrações de GHRH e muito pouca somatostatina. A somatostatina inibe a liberação de GHRH no bioensaio, portanto, sua presença confundiu a monitoração da purificação do GHRH. O extrato deste tumor simplificou muito o processo (porque tinha altas concentrações de GHRH e pouca somatostatina estava presente), em comparação com tentativas anteriores utilizando centenas de milhares de hipotalamis de animais que eram ricos em somatostatina e tinham concentrações muito pequenas de GHRH. Este foi o primeiro exemplo de um único tumor humano usado para identificar e isolar um hormônio. A proteína relacionada ao PTH foi isolada com uma técnica similar usando uma linha de células tumorais humanas.

Como clínicos, todos nós temos a responsabilidade de identificar experiências da natureza e aproveitar as oportunidades para fazer perguntas que seriam muito difíceis de responder de qualquer outra forma. Os experimentos da natureza são frequentemente únicos, e certamente os 15 ou 20 pacientes que vieram antes deste forneceram pistas que um tumor de um paciente com secreção ectópica de GHRH poderia responder à questão da natureza e estrutura do GHRH. De facto, o grupo do Dr. Guillemin tomou conhecimento posteriormente de outro tumor da Dra. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, França), e como tinham mais tecido daquele tumor, estudaram-no mais agressivamente do que o de Charlottesville. Entretanto, foi o tumor original de Charlottesville que sugeriu que tal tumor poderia oferecer a chave para a busca do GHRH.

O estudo subsequente da fisiologia do GHRH e seu potencial terapêutico como tratamento da deficiência de GHRH em crianças tem sido o foco do trabalho do nosso grupo nos últimos 17 anos (9, 10). Inicialmente, administrámos GHRH a voluntários normais e demonstrámos a sua eficácia e especificidade no aumento das concentrações séricas de GH (11). Em seguida, determinamos a resposta do GHRH a uma injeção aguda de GHRH em crianças com deficiência idiopática de GH (Fig. 4). Muitas das crianças tiveram um aumento muito robusto do GH, enquanto em algumas houve um pequeno ou nenhum aumento (12); a resposta ao GHRH foi maior do que à arginina e à l-dopa. Com base nestes resultados, propusemos que muitas crianças com deficiência idiopática de GHRH realmente sofressem de deficiência de GHRH.

Foi então iniciado um estudo multicêntrico do tratamento com GHRH. Isto pareceu particularmente apropriado porque o GH usado para tratar a deficiência de GH era derivado de cadáveres e tinha sido implicado na transmissão da doença de Jacob Creutzfeld. Um total de 24 crianças foram tratadas; em 10 crianças foi utilizada uma bomba para administrar um bolo de GHRH a cada 3 h. Esta via e dose foram escolhidas para imitar a fisiologia normal de aproximadamente um pulso de GH a cada 3 h em crianças em crescimento. Além disso, 10 crianças foram tratadas com a bomba a cada 3 h somente durante a noite, e 4 crianças receberam duas injeções diárias de GHRH. As velocidades de crescimento nas crianças antes e aos 6 meses de tratamento são mostradas na Fig. 5 (13).

Baseado nos resultados deste estudo, os Laboratórios Serono, Inc. iniciaram um estudo multicêntrico de 12 meses com GHRH(1-29)-NH2 administrado sc uma vez por dia (14). As crianças que estavam crescendo mais lentamente tiveram o maior aumento na velocidade de crescimento (Fig. 6). Isto sugere que o GHRH pode restaurar a secreção fisiológica do GH. O GHRH é aprovado pela Food and Drug Administration para uso diagnóstico, bem como para o tratamento da deficiência de GH em crianças. O GHRH é seguro e acelera efetivamente a velocidade de crescimento na maioria dos pacientes com deficiência de GH.

Na época em que o GHRH foi sintetizado havia um grande interesse na regulação da resposta da gonadotropina ao hormônio liberador de gonadotropina. Ficamos intrigados com uma observação em outro paciente com secreção ectópica de GHRH a partir de um tumor carcinoide metastático que deu origem à acromegalia. Apesar dos níveis persistentemente elevados de GHRH ao longo das 24 horas, o padrão de liberação de GHRH ainda era pulsátil, indicando que presumivelmente existem outros fatores envolvidos na regulação do padrão pulsátil de secreção de GH (15). Tem sido sugerido que isto pode ser devido à retirada da somatostatina. Assim, a secreção ectópica de GHRH demonstra inequivocamente que um agonista de ação prolongada pode aumentar a secreção pulsátil de GHRH. Estudos contínuos de infusão de GHRH iv em indivíduos normais demonstram o mesmo fenómeno e, assim, é claro que uma preparação de GHRH em depósito pode ser um agente terapêutico útil.

O nosso grupo (16) e Mayo (17) clonaram o receptor de GHRH. É interessante que o receptor GHRH é um membro da classe B de receptores acoplados à proteína G, que inclui os receptores para a família glucagon/secretina de peptídeos, bem como CRH, calcitonina e hormônio paratireoidiano. A sua estrutura é totalmente diferente da do rhodopsin (família A) de receptores maiores. No entanto, existem também sete domínios transmembrana nesta família de receptores.

O papel crítico do GHRH é demonstrado pelo rato anão que tem uma mutação pontual no receptor GHRH (18, 19). Wajnrajch et al. (20) descreveram uma mutação sem sentido (Glu 72stop) no receptor GHRH humano causando falha de crescimento e deficiência de GH em duas crianças da mesma família de muçulmanos indianos. Maheshwari et al. (21) descreveram uma parentela no Vale do Sindh, no Paquistão, com a mesma mutação. Membros dessa espécie são de estatura extremamente baixa. Outra mutação no receptor foi descrita em uma grande parentela brasileira que inclui mais de 110 indivíduos afetados com deficiência grave de GH e estatura extremamente curta (22). Estas experiências da natureza demonstram que um defeito no receptor GHRH prejudica o crescimento normal e enfatiza a importância vital do GHRH.

Um desenho animado do receptor GHRH é mostrado na Fig. 7 (10). Ácido aspártico na posição 60 desde o início do códon é o local da mutação acesa do rato. Para estudar membranas de células HEK293 transfectadas com ADN complementar para o receptor GHRH foi utilizado um anti-soro receptor C-terminal de GHRH que foi elevado a um peptídeo com base na sequência do receptor humano GHRH. Os estudos indicam que o receptor aceso do rato é traduzido em proteína e está realmente presente na membrana das células pituitárias do rato aceso. Propusemos que esta mutação leva a uma mudança na estrutura terciária do receptor, o que impede a ligação (23). Usando sondas de afinidade fotográfica, nossas evidências sugerem que outros locais estão muito próximos ao GHRH ligado, indicando que vários locais de interação são provavelmente necessários para a transdução de sinal. A disponibilidade do receptor recombinante viabiliza a busca de agonistas de GHRH não peptídicos.

Em conclusão, o conhecimento adquirido a partir da observação cuidadosa de um único paciente com acromegalia levou ao isolamento, caracterização e síntese do GHRH. Estudos adicionais conduziram à introdução do tratamento da deficiência de GHRH. Posteriormente, nós e outros fomos capazes de clonar o receptor para GHRH. Estudos com GHRH confirmaram que ele é essencial para a síntese do GHRH e para o crescimento normal. Esta posição é agora validada por observações de que as mutações do receptor GHRH, que resultam na sua inactivação, levam a uma deficiência profunda de GHRH e a uma estatura curta severa e completam o círculo do nosso entendimento da regulação do GHRH.

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