Introdução

Números avanços em vários campos de pesquisa, incluindo biologia do desenvolvimento, biologia de células estaminais e tecnologia de engenharia de tecidos, têm facilitado a medicina regenerativa . A primeira geração da medicina regenerativa é a terapia de transplante de células estaminais com células estaminais derivadas de tecidos, células estaminais embrionárias (ES) ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) . Por exemplo, o transplante de medula óssea já se tornou um tratamento comum para a leucemia e a anemia hipoplásica. Além disso, tanto as células ES como as células iPS estão a entrar em ensaios clínicos para muitas doenças e lesões, incluindo leucemia, doença de Parkinson e doença de Alzheimer, enfarte cardíaco, diabetes, doença hepática e várias outras condições . A regeneração tecidual está posicionada como a segunda geração da medicina regenerativa, e vários produtos, incluindo pele e cartilagem, já estão no mercado. Além disso, a primeira terapia de regeneração tecidual do mundo usando células iPS derivadas do paciente ou de um doador anônimo está sendo investigada em um ensaio clínico para curar a degeneração macular relacionada à idade .

A próxima geração de terapia regenerativa visa órgãos inteiros compostos de múltiplos tipos de células com uma estrutura tridimensional complexa . Nesta década, os avanços no campo da biologia das células-tronco e da biologia do desenvolvimento têm proporcionado novas oportunidades para regenerar órgãos funcionais. Durante o desenvolvimento embrionário, os órgãos surgem dos respectivos germes dos órgãos, que são induzidos por interações recíprocas entre células-tronco epiteliais e mesenquimais determinadas pelo destino, de acordo com os campos de formação de órgãos individuais (figura 1a) . A regeneração funcional de órgãos foi conseguida pela primeira vez em 2007 através do desenvolvimento de um novo método de manipulação celular para gerar um germe de órgão bioengenharia com células-tronco epiteliais e mesenquimais de potencial epitelial e mesenquimal isoladas de um germe de órgão embrionário (figura 1b) . Este estudo pioneiro e estudos subsequentes relataram a regeneração totalmente funcional de múltiplos tipos de órgãos ectodérmicos, fornecendo evidências para o conceito de regeneração funcional de órgãos .

A próxima mudança de paradigma veio em 2008 com a descoberta dos organóides, que foram gerados pela indução de um campo de formação de órgãos em um agregado celular resultante de células-tronco pluripotentes como células ES e células iPS, assim como células-tronco teciduais (figura 1c) . Praticamente todos os tipos de organóides podem ser gerados, incluindo os do sistema nervoso central (ou seja, córtex cerebral, hipófise, copo óptico e ouvido interno) . Embora o surgimento do organóide represente um avanço tecnológico que agora serve como uma ferramenta essencial em muitas aplicações biológicas e clínicas básicas, os organóides ainda podem reproduzir apenas parcialmente a estrutura e função dos órgãos originais. Portanto, a maioria dos organóides gerados até hoje poderiam substituir as funções limitadas e/ou parciais de um órgão completo, sendo assim atualmente considerados como mini-orgãos. Recentemente, foram desenvolvidos com sucesso organóides de glândulas salivares que demonstram regeneração de órgãos totalmente funcionais com transplante ortotópico. Como os princípios do desenvolvimento de órgãos ectodérmicos são semelhantes aos de outros órgãos, é importante obter um entendimento mais profundo da regeneração de órgãos ectodérmicos para alcançar a regeneração funcional completa de outros órgãos (figura 1a). Além disso, a regeneração de um sistema orgânico integumentar (IOS) usando um método organóide in vivo demonstrou claramente a possibilidade de regeneração do sistema orgânico .

Nesta revisão, descrevemos os progressos recentes na regeneração de órgãos usando várias populações de células-tronco e estratégias baseadas na biologia do desenvolvimento e na biologia das células-tronco e discutimos as direções futuras para a terapia de substituição de órgãos como a próxima geração da medicina regenerativa de órgãos.

Desenvolvimento de um método de manipulação tridimensional de células, o método do germe de órgãos, usando células embrionárias

Pesquisadores têm tentado regenerar órgãos por várias décadas combinando células funcionais, materiais de andaimes e substâncias fisiologicamente ativas usando técnicas de engenharia de tecidos . Embora estes estudos anteriores tenham dado algumas contribuições para a regeneração de órgãos, existem preocupações consideráveis em relação aos resultados destes estudos, tais como a baixa eficiência da indução de órgãos e a direção e tamanho incontroláveis do órgão regenerado. Com os avanços na biologia do desenvolvimento e das células-tronco, a reprodução da organogênese na fase fetal tem progredido nos últimos 30 anos. O processo de desenvolvimento da regeneração de órgãos começa com a indução do germe do órgão por interações epiteliais-mesqueléticas no campo do órgão que se formam após o estabelecimento do plano do corpo durante o desenvolvimento inicial. Técnicas de manipulação celular concebidas para regenerar germes de órgãos foram desenvolvidas ao longo dos anos, mas a reprodução completa do desenvolvimento e regeneração de órgãos funcionais não foi alcançada .

Desenvolvemos um método de bioengenharia, designado método do germe de órgão, para recapitular a indução do germe do órgão através de interações epiteliais e mesenquimais em estágios iniciais de desenvolvimento . Compartimentamos células epiteliais e mesenquimais isoladas do embrião de camundongo a uma alta densidade celular em um gel de colágeno tipo I para obter uma replicação precisa dos processos que ocorrem durante a organogênese. Utilizando este novo método, observamos a regeneração funcional de múltiplos tipos de órgãos ectodérmicos, tais como dentes, folículos pilosos e glândulas secretoras .

Dentes com bioengenharia totalmente funcional

3.1. Desenvolvimento dentário

No desenvolvimento do germe dentário, a lâmina dentária inicialmente engrossa (estágio da lâmina) (figura 2a). O germe dentário desenvolve-se e interage com o epitélio da mucosa oral e mesênquima. Posteriormente, o espessamento epitelial na localização futura do dente e o subseqüente brotar epitelial (estágio de gema) para o mesênquima derivado da crista neural subjacente são induzidos por sinais epiteliais em dias embrionários (DE) 11-13 em camundongos. Nos DE 13-15, o nó de esmalte actua como centro de sinalização responsável pela formação e manutenção da papila dentária. Os nós primários do esmalte são formados na gema do dente e aparecem durante a transição da fase de gema para a fase de tampa. Nos EDs 17-19, as células epiteliais e mesenquimais do germe dentário diferenciam-se terminalmente. O mesênquima também se diferencia em polpa dentária e tecidos periodontais, que se tornarão o cemento, ligamento periodontal e osso alveolar. A formação da raiz dentária é iniciada após a formação da coroa dentária, e os dentes maduros irrompem para a cavidade bucal.

3.2. Regeneração dentária totalmente funcional

Perda de dentes devido a cárie dentária, doença periodontal ou traumatismo, causa problemas fundamentais com a função oral adequada e está associada a problemas de saúde bucais e gerais . Os tratamentos dentários convencionais concebidos para restaurar as funções oclusais após a perda dos dentes são baseados na substituição dos dentes por materiais artificiais, tais como próteses fixas ou removíveis e trabalho de pontes. Embora essas terapias artificiais sejam amplamente aplicadas no tratamento de distúrbios dentários, a recuperação de uma oclusão é necessária porque os dentes se coordenam com a força oclusal e a força ortodôntica dos músculos vizinhos, e a integridade do sistema estomatognático é retida pelo estabelecimento do sistema oclusal durante o crescimento da mandíbula no período pós-natal . Avanços recentes na regeneração tecidual permitiram aos pesquisadores melhorar as funções dos dentes biológicos, facilitando o desenvolvimento dentário subjacente através da remodelação óssea e ajudando na capacidade de perceber estímulos nocivos .

Como mostrado em nosso estudo anterior, um germe dentário bioengenharia desenvolve-se na estrutura dental correta e irrompe com sucesso na cavidade bucal após o transplante para a região do dente perdido (figura 2b) . No caso de uma unidade de dente maduro transplantado com bioengenharia composta por um dente maduro, ligamento periodontal e osso alveolar pode ser enxertado na região da perda dentária através da integração óssea no receptor (figura 2c) . O dente bioengenharia mantém as interações com o ligamento periodontal e o osso alveolar originário da unidade dentária bioengenharia através da integração óssea bem sucedida. A dureza do esmalte e da dentina dos componentes do dente bioengenharia dentária estavam dentro da faixa de normalidade quando analisados através do teste de dureza Knoop . Como uma direção futura, o controle da forma do dente é considerado importante. Os dentes são gerados orientando o mesênquima de acordo com o plano do corpo durante o processo de desenvolvimento. Quanto ao controle morfológico dentário, a largura do dente é controlada pela área de contato entre as camadas epiteliais e mesenquimais, e o número de cúspides é controlado pela expressão de Shh no epitélio interno do esmalte. Essa tecnologia dentária bioengenharia contribui para a realização de uma terapia regenerativa de substituição dentária integral como uma terapia de próxima geração.

Fully functional bioengineered hair follicle

4.1. Desenvolvimento do folículo piloso

Ratos têm quatro tipos diferentes de cabelo nas suas costas, classificados como pêlos de guarda, awl, auchene e ziguezague. O desenvolvimento do folículo piloso na pele posterior do rato começa com a determinação do destino das células mesenquimais em aproximadamente ED 10,5, resultando na formação de um condensado dérmico. As interacções recíprocas entre o condensado dérmico e a epiderme sobreposta levam à indução do placodio capilar (figura 3a). Uma vez estabelecido o placodio capilar, o desenvolvimento do folículo piloso ocorre em três ondas, começando com o desenvolvimento do cabelo de guarda no ED 14,5, seguido pelo cabelo awl e auchene no ED 17 e pelo ziguezague no nascimento. A extremidade inferior do epitélio que envolve uma célula dérmica condensada forma o germe da matriz capilar. A célula dérmica condensada forma uma papila dérmica, que é considerada um nicho para células-tronco mesenquimais do folículo piloso, e induz a diferenciação da matriz capilar e forma a bainha interna da raiz do folículo piloso e a haste capilar. A região do bojo também forma um nicho de células-tronco do epitélio e simultaneamente se conecta com as fibras nervosas e com o músculo pili do músculo eretor (figura 3a) .

4.2. Regeneração folicular totalmente funcional

O órgão capilar tem as funções biológicas de termorregulação, isolamento físico da radiação UV, impermeabilização, sensação tátil, proteção contra estímulos nocivos, camuflagem e comunicação social . Os distúrbios da queda capilar, como a displasia congênita do folículo piloso e a alopecia androgenética, são psicologicamente angustiantes e têm efeitos negativos na qualidade de vida de ambos os sexos . Os tratamentos farmacológicos actuais são insuficientes para conseguir o controlo ideal da queda de cabelo, como a displasia congénita do folículo capilar ou a alopecia areata . A demanda pelo desenvolvimento de tecnologias de bioengenharia que permitam a terapia regenerativa da queda de cabelo aumentou.

No ciclo capilar, os germes do folículo piloso são reconstituídos periodicamente, e células-tronco epiteliais e mesenquimais capazes de regenerar os folículos capilares estão presentes, mesmo em adultos. Portanto, este órgão é o único órgão para o qual os germes reconstituintes podem ser regenerados a partir de células derivadas do adulto. Foi relatado um transplante autólogo de folículo piloso no qual um único folículo piloso é isolado da região saudável do couro cabeludo e transplantado em pacientes com alopécia de padrão masculino, e os folículos pilosos transplantados mantêm suas características. Segundo muitos pesquisadores, a substituição de células dérmicas na pele por células mesenquimais, que são coletadas de bulbos capilares adultos em um folículo piloso, induz a formação de novos folículos capilares. No entanto, a regeneração dos folículos pilosos que funcionam em cooperação com o tecido circundante é difícil. Nosso grupo reconstituiu um germe do folículo piloso bioengenharia, que contém células-tronco mesenquimais, utilizando células epiteliais derivadas do bulbo e células da papila dérmica isoladas não só de embriões, mas também de ratos adultos (figura 3b) . Após o transplante ortotópico, os germes do folículo piloso bioengenharia desenvolvem-se em folículos pilosos maduros com estruturas adequadas e produzem pêlos ao longo da sua vida (figura 3c). Além disso, os folículos capilares regenerados conectam-se eficientemente com o tecido hospedeiro circundante e apresentam reflexo pilomotor em resposta à administração de acetilcolina (figura 3d). Este estudo demonstrou o potencial das células estaminais teciduais isoladas dos folículos pilosos adultos para se desenvolverem em folículos pilosos humanos no campo da medicina regenerativa.

Glândulas secretoras bioengenharia totalmente funcional

5.1. Desenvolvimento das glândulas salivares e lacrimais

Glândulas secretoras, incluindo glândulas salivares e lacrimais, são vitais para a protecção e manutenção das funções fisiológicas no microambiente das superfícies oral e ocular. As glândulas secretoras desenvolvem-se através de interacções entre epiteliais e mesenquimais recíprocas. As glândulas salivares são classificadas em três tipos principais: a glândula parótida (PG), a glândula submandibular (SMG) e a glândula sublingual (SLG). A SMG desenvolve-se através da invaginação do epitélio para a região mesenquimatosa no ED 11. O tecido epitelial invaginado prolifera para formar um talo epitelial (figura 4a) . Um botão terminal forma uma estrutura ramificada desenvolvendo uma fenda e repetindo o processo de alongamento e ramificação dos DE 12,5-14,5 . Os bulbos terminais se diferenciam em células acinares e amadurecem para sintetizar proteínas secretoras no ED 15 . Em contraste, a glândula lacrimal também se desenvolve através da invaginação do epitélio em um saco mesenquimal em uma região temporal do olho sobre DE 12,5. Os botões epiteliais arredondados condensam-se no fórnice conjuntival superior, que depois invaginam no mesênquima circundante. O germe da glândula lacrimal forma ramos através do alongamento do talo e formação de fenda morfogênese. A estrutura fundamental da glândula lacrimal é obtida por ED 19 .

5.2. Regeneração das glândulas salivares e lacrimais

A boca seca e o olho seco são sintomas comuns. As doenças das glândulas salivares incluem tumores salivares, distúrbios obstrutivos, infecções e os sintomas de doenças sistêmicas, como a síndrome de Sjögren, linfoma e doenças metabólicas . Estas doenças também afectam as glândulas lacrimais, resultando em olho seco . Disfunções e distúrbios associados a essas glândulas exócrinas resultam em uma redução geral na qualidade de vida. No entanto, as terapias atuais para doenças caracterizadas pela boca seca e olho só tratam os sintomas . Estas terapias apenas exercem efeitos temporários e não revertem a disfunção da glândula exócrina.

O nosso grupo teve como objectivo desenvolver melhores tratamentos através da reconstituição de um germe de glândula salivar bioengenharia a partir de células epiteliais e mesenquimais derivadas de germes da glândula endócrinativa 13,5-14,5 embrionárias de camundongos utilizando o nosso método desenvolvido de germes de órgãos (figura 4b) . Após o transplante ortotópico após a remoção das glândulas salivares nativas, o germe da glândula salivar bioengenharia desenvolveu-se em uma glândula salivar madura, e uma conexão adequada foi formada entre o ducto salivar hospedeiro e o ducto salivar bioengenharia (figura 4b). Este procedimento levou ao desenvolvimento de um ducto salivar conectado no rato receptor com estruturas de tecido acinar semelhantes à glândula salivar natural (figura 4c). O SMG bioengenharia regenerava células acinares serosas e exibia uma estrutura de órgão natural. A entrada nervosa nestas glândulas salivares bioengenharia também foi observada, e a secreção de saliva foi induzida na glândula salivar por estimulação da papila gustativa usando ácido cítrico (figura 4d).

Nós também reconstituímos um germe de glândula lacrimal bioengenharia a partir de células epiteliais e mesenquimais derivadas dos germes da glândula lacrimal do embrião de ED 16,5 de camundongo. O germe de glândula lacrimal bio-engenharia, que foi gerado usando o método do germe de órgão, foi submetido com sucesso à morfogênese ramificada. Após o transplante, estas glândulas desenvolveram-se em estruturas glandulares secretoras maduras in vivo. Estes resultados confirmaram a possibilidade de regenerar uma glândula secretora bioengenharia utilizando transplante de germes de órgãos.

Geração de organóides como mini-orgãos a partir de células estaminais pluripotentes

Organóides, que reproduzem a estrutura parcial e função dos órgãos, foram gerados a partir de células estaminais multipotentes com base no conceito de recapitular o processo de indução de um campo de formação de órgãos com posterior auto-organização durante a organogénese embrionária. Esta indução foi obtida através da utilização de várias combinações de citocinas, que imitam o padrão e o posicionamento da sinalização no embrião. Este conceito foi provado pela primeira vez pela geração bem sucedida de um organóide de vaso óptico a partir de células ES . Posteriormente, vários organóides foram induzidos em cada campo formador de órgãos, como a retina, hipófise, cérebro, ouvido interno e folículo piloso no campo da cabeça; tiróide e pulmão no campo do tórax; e intestino delgado, estômago e rim no campo do abdômen.

Células-tronco de tecido adulto, como as células-tronco intestinais, pulmonares, gástricas e pancreáticas, também são capazes de gerar organóides através da auto-organização de seu nicho, que podem reproduzir parcialmente a estrutura do tecido original. Embora a definição de um organóide seja ligeiramente diferente dependendo da sua origem (ou seja, células estaminais pluripotentes ou células estaminais tecidulares), os organóides recapitulam parcialmente a estrutura do órgão ou tecido e podem crescer até um tamanho pequeno e limitado, sendo assim considerados mini-orgãos. Portanto, ao contrário de um germe de órgão bioengenharia, um organóide é incapaz de substituir completamente as funções dos seus órgãos originais após o transplante ortotópico por si só; no entanto, o transplante ortotópico e heterotópico de múltiplos organóides pode recuperar parcialmente a função do órgão .

Recentemente, regeneramos com sucesso uma glândula salivar totalmente funcional a partir de células ES do rato in vivo (figura 4e,f) . Usando o método geral de formação de organóides, geramos a glândula salivar primordium como um organóide através da indução de um campo formador de órgãos (ou seja, o ectoderme oral), que foi então transplantado ortotopicamente. O organóide transplantado evoluiu para uma glândula salivar madura com a estrutura tecidual correta, como o tecido acinar, e formou conexões apropriadas com os tecidos circundantes, incluindo o ducto PG e os nervos. Além disso, a glândula salivar regenerada segregou saliva em resposta à estimulação gustativa usando ácido cítrico, demonstrando a recuperação funcional completa da glândula salivar original após o transplante ortotópico do organóide (figura 4f). Estes estudos demonstram claramente a viabilidade da regeneração funcional dos órgãos utilizando organóides, gerados pela indução do campo de formação de órgãos em células estaminais multipotentes, e não em células estaminais embrionárias potenciais indutoras de órgãos. O desenvolvimento do novo sistema de cultura in vitro que permite que organóides de grandes órgãos, como fígado e rim, cresçam até um tamanho apropriado deve ser o próximo tópico de pesquisa para alcançar a regeneração de órgãos.

Regeneração de uma IOS tridimensional a partir de células iPS

A função coordenada de múltiplos órgãos, colectivamente referidos como um sistema orgânico como o sistema nervoso central, sistema circulatório, sistema digestivo e IOS, é vital para sustentar a homeostase de um organismo . Portanto, a regeneração de todo o sistema orgânico é o próximo desafio no campo da medicina regenerativa. O IOS é o maior sistema orgânico do corpo. Este sistema contém vários órgãos, tais como folículos pilosos, glândula sebácea e glândula sudorípara, além do tecido da pele que é composto pela epiderme, derme e gordura subcutânea. O sistema de órgãos da pele desempenha papéis importantes na homeostase, como a secreção de humidade e sebo, e a protecção da luz ultravioleta e a estimulação externa através das hastes capilares. A lesão cutânea por queimaduras graves é uma ameaça à vida. Os defeitos congénitos e a perda de apêndices cutâneos afectam significativamente a qualidade de vida, embora seja possível um tratamento médico regenerativo parcial com folhas epidérmicas. A criação de pele artificial que compreende a epiderme e a derme, e a regeneração dos órgãos do folículo piloso através da manipulação celular, foram relatadas. No entanto, nenhum sistema de órgãos da pele foi regenerado.

Recentemente, nós regeneramos com sucesso o IOS induzindo um campo de formação de órgãos em corpos embrionários (EBs) derivados de células iPS do rato (figura 5a) . Após o transplante de EBs para a cápsula subrenal, a geração de apêndices cutâneos incluindo folículos pilosos, glândulas sebáceas e tecido adiposo subcutâneo foi confirmada na IOS bioengenharia sem tumorigenese (figura 5b,c). Além disso, o número e densidade de cabelos regenerados na IOS bioengenharia foram os mesmos encontrados em cabelos naturais, sugerindo que a organogênese na IOS ocorreu de forma semelhante à do desenvolvimento normal. A IOS bioengenharia gerada na cápsula subrenal foi totalmente funcional após o transplante para a pele posterior de ratos nus, como evidenciado pelo ciclo capilar repetitivo (figura 5d). Este estudo comprovou o conceito de regeneração do sistema orgânico in vivo. Do ponto de vista da aplicação prática, uma nova estratégia para gerar um sistema orgânico in vitro é desejada. Uma dessas estratégias poderia ser montar os múltiplos tipos de organóides como partes. A investigação para controlar a configuração dos organóides e cultivá-los in vitro será a próxima tendência no campo da medicina regenerativa.

Conclusão e perspectivas futuras

Nesta década, estudos de regeneração de órgãos a partir da tecnologia de bioengenharia deram grandes passos para a realização da terapia regenerativa de órgãos, incorporando os conceitos da biologia das células-tronco e da biologia do desenvolvimento. Com base nos resultados dos estudos organóides, praticamente todos os mini-organos podem ser gerados a partir de células estaminais pluripotentes ou células estaminais tecidulares, dissipando as preocupações sobre a fonte celular para a terapia regenerativa de órgãos. A regeneração funcional de órgãos ectodérmicos utilizando células isoladas de germes de órgãos embrionários, células estaminais potenciais indutoras de órgãos e células estaminais pluripotentes provam o conceito de terapia de substituição de órgãos.

O desenvolvimento de um sistema de cultura tridimensional in vitro com a capacidade de cultivar organóides e germes de órgãos até um tamanho apropriado é essencial para alcançar a regeneração funcional de múltiplos órgãos e sistemas de órgãos. Os actuais sistemas de cultura in vitro não permitem o crescimento ou manutenção adequados de organóides ou germes de órgãos devido ao aparecimento de necrose no interior destes tecidos, principalmente devido à falta de um fornecimento de nutrientes. In vivo, o sistema de circulação sanguínea é essencial para manter as funções dos órgãos através do transporte de oxigénio, fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos. Os recentes progressos na engenharia de tecidos mostraram que a rede vascular administra substâncias biológicas para o interior do esferóide celular. Além disso, previamente desenvolvemos um sistema de cultura de perfusão de órgãos utilizando uma rede vascular que manteve o fígado de rato em condições saudáveis por um período prolongado, fornecendo pistas para o desenvolvimento de um novo sistema de cultura tridimensional.

Porque as células estaminais do folículo piloso são as únicas células estaminais adultas com potencial indutor de órgãos que podem ser transplantadas de forma autógena, o primeiro ensaio clínico humano de terapia regenerativa de órgãos irá, sem dúvida, investigar a regeneração do folículo piloso. A regeneração dos folículos pilosos utilizando o nosso método de germinação de órgãos está agora a ser investigada num estudo pré-clínico para curar pacientes que sofrem de alopecia androgénica, com o objectivo de realizar ensaios clínicos em 2020. Esta terapia regenerativa dos folículos pilosos será um marco nas terapias regenerativas dos órgãos e levará ao desenvolvimento de material e de uma infra-estrutura responsiva para a realização da medicina regenerativa dos órgãos. A aplicação do conhecimento da regeneração do folículo piloso e dos conhecimentos obtidos em ensaios clínicos a outros germes de órgãos ou organóides irá permitir a regeneração de outros órgãos a partir de células estaminais pluripotentes e tecidulares em combinação com tecnologias organóides nas próximas décadas.

Acessibilidade aos dados

Este artigo não tem dados adicionais.

Contribuições dos autores

T.T. desenhou esta revisão. E.I., M.O., M.T. e T.T. escreveram o manuscrito.

Interesses concorrentes

Este estudo foi realizado sob um acordo de invenção entre a Riken e a Organ Technologies Inc. (Organ Technologies Inc.). T.T. é diretor da Organ Technologies Inc.

Funding

A publicação desta revisão foi parcialmente apoiada por uma subvenção para o KIBAN (A) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (subvenção nº 25242041) e por uma subvenção de colaboração (para T.T.) da Organ Technologies Inc. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Organ Technologies Inc.

Pés