O Teste do Lisado Amebocitário de Limulus (LAL) é um método para a detecção e quantificação de endotoxinas bacterianas que é amplamente utilizado pela indústria farmacêutica e biotecnológica. O princípio bioquímico do teste é baseado na reacção de coagulação da hemolinfa do Limulus polyphemus, vulgarmente conhecido como Caranguejo Ferradura do Atlântico, na presença de antigénios com superfície microbiana, como os Lipopolissacáridos ou endotoxinas bacterianas.

A empresa “Wako Chemicals” está entre as empresas que fabricam reagentes LAL a nível internacional devido à sua fórmula única de um reagente LAL específico para endotoxinas bacterianas sem a interferência de beta glucanos nas amostras, graças à adição de carboximethylated Curdlan (CMC) coliophylized with LAL. Sob a marca PYROSTAR™, esta empresa distribuidora de reagentes de pesquisa fabrica e comercializa os reagentes e acessórios LAL que cumprem todas as normas, regulamentos e padrões de qualidade estabelecidos pela FDA dos EUA.

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Vamos agora falar sobre os diferentes reagentes e acessórios com que a Wako contribui para o estudo das endotoxinas bacterianas:

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Primeiro, temos o kit Teste Simples Limulus PS, que permite a detecção e quantificação de endotoxinas sem a interferência de outras substâncias coexistentes com o uso de um adsorvente de afinidade para endotoxinas chamado Pyrosep™. Com este método, podemos medir a endotoxina numa amostra lipofílica desde que esta possa ser dissolvida em etanol, tais como vitaminas lipossolúveis, óleos e gorduras, albuminas, etc. que normalmente não podem ser medidas com um teste Limulus convencional. Além disso, nenhum reagente LAL é desperdiçado, pois é aplicado individualmente em frascos do teste simples e pode ser usado na quantidade exata necessária para a medição.

A série PYROSTAR™ ES-F é uma formulação única contendo carboximethylated Curdlan (CMC) coliophylized com LAL com o objetivo de remover a interferência com β-glucans. O tampão ES desenvolvido pela Wako contém altas concentrações de CMC, transformando-se num reagente de LAL específico para endotoxinas. Este reagente foi concebido para ser utilizado tanto na detecção qualitativa de endotoxinas através do método gel-clot como para a sua detecção quantitativa através dos métodos cinéticos turbidimétricos (KTA). Um instrumento fotométrico chamado Toxinómetro®, desenvolvido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd. é utilizado para medir a velocidade da alteração da turbidez. Os kits PYROSTAR™ ES-F estão disponíveis com e sem a Endotoxina de Controlo Standard (SCE): um reagente liofilizado refinado de E.coli e utilizado para confirmar a sensibilidade do reagente LAL, validar os métodos de teste do produto e preparar controlos de inibição.

Para suportar estes reagentes, a Wako está também a desenvolver uma Solução de Extracção de Endotoxina capaz de extrair endotoxinas de superfícies onde estas não podem ser extraídas com água ou sal. A sua utilização é recomendada em amostras de endotoxinas em equipamentos e dispositivos que possam estar em contacto com líquidos que contenham sangue ou proteínas.

Toxinometer® ET-6000 é um leitor cinético de incubação computadorizado que pode incorporar 3 métodos de teste: gel-clot, KTA e KCA (teste cinético-cromogénico). Este equipamento permite-nos obter os resultados do gel-clot e KTA a partir da mesma amostra. Mede simultaneamente até 16 amostras com um risco de contaminação muito inferior ao da microplaca e permite-nos arquivar as curvas padrão. O Toximaster® QC7 é o software que fornece todas as funções para processamento de dados e preparação de relatórios para o teste LAL com o Toxinómetro® ET-6000.

Mais, entre os acessórios dos catálogos LAL da Wako, também vemos tubos de teste com e sem tampas de alumínio. Estes tubos são produzidos sem endotoxinas, feitos de vidro borosilicato e desenhados para o método gel-clot. A espessura do vidro pode ser especificamente calibrada para o Toxinómetro para uma intensidade luminosa estável e transmitância.

Outro reagente LAL comercializado pela Wako é o kit KY Color Limulus. Este reagente foi concebido para o método KCA e pode ser utilizado tanto no leitor cinético como num leitor de microplacas. Inclui um kit multi-teste e um kit de teste simples, cada um concebido para uma análise colorimétrica baseada no tempo, utilizando um substrato sintético que gera uma cor amarela e que pode especificamente detectar a endotoxina com alta sensibilidade.

Bibliografia:

1) Iwanaga, S. Princípio bioquímico do teste Limulus para detecção de endotoxinas bacterianas. Proceedings of the Japan Academy, Série B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, Dezembro (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerto 44 (1994), 21ª Reunião Anual da Sociedade de Agentes Antibacterianos e Antifúngicos.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discriminação entre endotoxina e (1-3) beta-D-glucan usando ensaio cinético turbidimétrico com lisado amebocitário de Limulus. Chem Pahrm Bull (Tóquio), 38(9). 2523. (1990).

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