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Por Elizabeth Burke

Terça-feira, 9 de Agosto, 2016

Os cientistas usam uma variedade de técnicas laboratoriais para investigar a causa genética das doenças humanas. A pesquisa frequentemente utiliza células ou amostras de tecidos de pacientes, mas para determinar se uma mutação em um gene específico pode causar os sintomas de um paciente, muitas vezes precisamos de modelos animais experimentais.

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Embora ratos e ratos tenham sido escolhas comuns para modelar doenças humanas no passado, o uso do zebrafish está rapidamente ganhando popularidade. Isto surpreende-o? Deixe-me explicar.

O que são zebrafish?

Zebrafish são peixes tropicais de água doce da família dos peixinhos. Na natureza, eles são encontrados em rios e lagoas da Índia, mas agora estão disponíveis em lojas de animais. O nome “zebrafish” vem das faixas azuis horizontais de cada lado do corpo.

Zebrafish, assim chamado devido às suas faixas, preferem viver em grandes grupos chamados cardumes.

Como se pode modelar uma doença humana nos peixes?

Embora os humanos possam parecer ser extremamente diferentes do zebrafish, na verdade somos muito mais parecidos com eles do que se possa pensar. De facto, 70% dos genes humanos são encontrados no zebrafish.

Além disso, o zebrafish tem dois olhos, uma boca, cérebro, medula espinal, intestino, pâncreas, fígado, canais biliares, rim, esófago, coração, ouvido, nariz, músculo, sangue, osso, cartilagem e dentes. Muitos dos genes e vias críticas que são necessários para o crescimento destas características estão altamente conservados entre humanos e zebrafish. Assim, qualquer tipo de doença que cause mudanças nessas partes do corpo em humanos poderia teoricamente ser modelada em zebrafish.

Por que usar zebrafish quando você poderia usar ratos?

Embora os ratos sejam evolutivamente mais parecidos com humanos por serem mamíferos, o zebrafish tem várias vantagens sobre seus competidores peludos.

Uma vantagem importante do zebrafish é que os adultos são pequenos e preferem ser alojados em grandes grupos, ou “cardumes”. Como resultado, eles requerem muito menos espaço e são mais baratos de manter do que os ratos.

O NIH Zebrafish Core abriga centenas de milhares de zebrafish em uma instalação de última geração.

Outra vantagem é que o zebrafish adulto se reproduz facilmente (aproximadamente a cada 10 dias) e pode produzir de 50 a 300 ovos de cada vez. Isto é bastante diferente dos ratos, pois geralmente produzem ninhadas de um a 10 filhotes e só podem suportar aproximadamente três ninhadas durante a sua vida útil. As experiências científicas são geralmente repetidas várias vezes a fim de provar que os resultados são precisos, portanto ter um animal que pode produzir um grande número de crias repetidas vezes é útil.

Embriões de zebra também são postos e fertilizados externamente, o que permite que eles sejam facilmente manipulados de várias maneiras. A fertilização in vitro pode ser realizada, se necessário. Os ovos fertilizados de uma célula podem ser facilmente injetados com DNA ou RNA para modificar permanentemente sua composição genética a fim de gerar linhas transgênicas ou linhas de zebrafish knock-out. Trabalhar com ratos desta forma é muito mais complicado. Os embriões de rato desenvolvem-se dentro da mãe, e para aceder e manipulá-los a mãe teria de ser sacrificada. Para manter os embriões vivos após fertilizá-los ou injetá-los, eles precisariam ser transplantados em outra fêmea de rato, também.

Larva de zebrafish, o estágio de desenvolvimento entre três e trinta dias após a fertilização, cresce em comprimento de aproximadamente 3,5 a 8 milímetros.

Outras vezes, os embriões de zebrafish são claros, o que permite aos cientistas ver os ovos fertilizados crescerem em peixes bebês completamente formados sob um microscópio. A sua transparência também permite a visualização de tecidos fluorescentes em embriões transgénicos de zebrafish. Os embriões de rato não são claros e desenvolvem-se dentro da mãe, portanto a observação do desenvolvimento de embriões vivos como os do zebrafish não é possível.

No entanto, há um limite para os tipos de doenças que podem ser estudadas no zebrafish. Doenças humanas causadas por genes que não existem no zebrafish requerem um modelo animal diferente. Além disso, zebrafish não são modelos úteis para doenças humanas que ocorrem principalmente em um tipo de tecido ou parte do corpo que o zebrafish não tem (por exemplo, próstata, glândulas mamárias, pulmões).

Como exatamente você usa o zebrafish para investigar doenças humanas?

O DNA de um paciente é seqüenciado a fim de encontrar uma mutação em um gene que poderia potencialmente causar os sintomas de sua doença. Para determinar se a perda da função desse gene pode causar os sintomas observados no paciente, o mesmo gene é mutado ou “knocked-out” em zebrafish, e então os peixes são examinados para sintomas semelhantes. Embora seja muito mais difícil de fazer, a mutação exacta que o paciente tem pode ser introduzida também no zebrafish, isto é chamado de “knock-in”.

Se um ou mais dos sintomas do paciente são observados no modelo zebrafish knock-out ou knock-in, o zebrafish pode ser usado para estudos adicionais para ajudar a determinar porque é que a mutação naquele gene causa a doença. Por exemplo, a estrutura das fibras musculares pode ser examinada ao microscópio para detectar anormalidades, se o paciente tiver uma doença muscular. Ou se os sintomas da doença do paciente começaram durante o desenvolvimento no útero, knock-out ou knock-in de embriões zebrafish podem ser examinados para ver se há alterações na expressão do gene (em comparação com embriões sem a mutação) que poderiam levar a um desenvolvimento anormal. Para um paciente com uma doença neurológica, os neurônios dos embriões knock-out podem ser rotulados fluorescentemente para ver se eles se formam incorretamente.

Além de utilizar modelos de doença de zebrafish para caracterizar doenças humanas, os pesquisadores também podem identificar e testar novos medicamentos para tratar as doenças que estão sendo modeladas. A capacidade do zebrafish de gerar muitos embriões cada vez que eles se reproduzem torna-os especialmente úteis para a triagem de medicamentos de alto rendimento.

Quais são alguns exemplos de doenças humanas que foram modeladas com sucesso no zebrafish?

A geração de um knock-out do gene da distrofina no zebrafish tem se mostrado muito parecida com a gravidade e progressão da doença humana Duchenne distrofia muscular. Foi constatado que pacientes com distrofia muscular de Duchenne carregam mutações na distrofina e demonstram fraqueza muscular infantil que se agrava progressivamente. Tanto em humanos como no modelo zebrafish, a perda da distrofina leva gradualmente a fibras musculares necróticas que são substituídas por células inflamatórias, fibrose e fibras musculares de tamanho anormal.

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Esta figura mostra diferenças visuais no músculo entre larvas zebrafish do tipo selvagem (A, B, C) e larvas distróficas (A’, B’, C’). Origem: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Melanoma humano também foi modelado com sucesso em zebrafish. A mutação mais comumente identificada nos melanomas humanos – uma única mudança de aminoácidos no gene BRAF – foi criada no zebrafish para fazer um modelo knock-in. Como os cancros são causados por uma combinação de várias alterações genéticas, esta linha de zebrafish knock-in foi usada para rastrear outros potenciais cancros causadores de mutações. Quando outra mutação de melanoma comumente observada do gene SETDB1 foi adicionada ao zebrafish BRAF knock-in, um melanoma desenvolveu-se rapidamente. Estes resultados ajudaram a estabelecer que o SETDB1 é um gene importante no crescimento do melanoma.

Estes exemplos de como humanos e o zebrafish podem manifestar a mesma doença apesar de parecerem diferentes fazem com que seja fácil entender porque o zebrafish está se tornando um modelo animal bem aceito. Aqui no Programa de Doenças Não Diagnosticadas do NIH, realizamos estudos utilizando o zebrafish como uma das várias abordagens para investigar o potencial envolvimento de genes alterados nas doenças extremamente raras dos nossos doentes. Embora no passado os ratos tenham sido a ponte animal predominante entre a bancada e o leito, estudos recentes demonstraram o potencial do zebrafish para servir como uma alternativa rastreável aos ratos. O timing da adopção do zebrafish como um organismo modelo emergente não poderia ser melhor, uma vez que os estudos com ratos muitas vezes não conseguem traduzir-se para os seres humanos. Embora nenhum animal possa modelar perfeitamente uma doença humana, acredito que estes pequenos nadadores às riscas têm grande potencial para o avanço da pesquisa médica no futuro.

Para saber mais sobre como o zebrafish contribui para a ciência biomédica e a saúde humana, visite os sites da Iniciativa Trans-NIH Zebrafish e do NICHD Zebrafish Core.