Abstract

Infecção pelo vírus Epstein-Barr ativo crônico (CAEBV) é uma doença grave com ativação incomum do EBV que persiste por anos, e a sua patogénese é em grande parte desconhecida. Após a criação de um sistema preciso e reprodutível de reacção em cadeia da polimerase para quantificar o ADN EBV, foram determinadas cargas de vírus nos linfócitos do sangue periférico (PBL) em 54 crianças: 15 com CAEBV, 16 com mononucleose infecciosa (IM), e 23 crianças saudáveis. As crianças com CAEBV e aquelas com IM tinham cargas de vírus elevadas. Cargas menores foram detectadas em 47% dos doadores soropositivos saudáveis. Havia duas diferenças distintas entre as crianças com CAEBV e as que tinham MI: A primeira tinha maior replicação viral (103-107 cópias/PBL)2,5 × 105 PBL) do que aquelas com MI, e a replicação viral diminuiu em crianças com MI, enquanto a replicação ativa persistiu por anos em indivíduos com CAEBV. A persistência de cargas elevadas de vírus é um possível critério de diagnóstico para o CAEBV. As cargas de EBV podem permitir a classificação e o prognóstico das infecções por EBV.

Epstein-Barr virus (EBV) é um agente causador da mononucleose infecciosa (IM) e da infecção crónica activa por EBV (CAEBV). O CAEBV é uma doença grave com activação invulgar do EBV que pode ser fatal com falência de múltiplos órgãos, e está associado a linfoma maligno sem imunossupressão prévia. Os sintomas clínicos do CAEBV e as anomalias serológicas correspondentes à replicação ativa do EBV, tais como anticorpo anti-EA-DR acentuadamente elevado e ausência do antígeno nuclear Epstein-Barr (EBNA), persistem por meses a anos. O EBV replica-se nas células NK , T e B.

Após a infecção estar estabelecida, o EBV geralmente reside nos linfócitos B durante toda a vida do hospedeiro sem causar quaisquer sintomas clínicos (designados por infecção latente). Portanto, não só a detecção mas também a quantificação do EBV nos tecidos afectados é essencial para investigar a doença do EBV.

Para clarificar o estado da replicação do EBV em pessoas com CAEBV, utilizámos a reacção semiquantitativa de DNA polimerase em cadeia (PCR) para avaliar e comparar as cargas de vírus nos linfócitos do sangue periférico (PBL) em 3 grupos de crianças: um com CAEBV, outro com IM e controlos saudáveis. Nosso sistema de detecção foi considerado preciso e confiável para a quantificação do EBV porque amplificamos uma região com uma única cópia do EBV. A maioria dos estudos anteriores visou a região BamHI-W para a qual a frequência de repetição em tandem é inconstante. Acreditamos que este estudo é o primeiro e maior estudo em escala de cargas de vírus em PBL de crianças com CAEBV.

Materiais e Métodos

Patientes e controles

Examinamos 16 crianças com MI (11 meninos, 5 meninas; idades, 0-8 anos), 15 com CAEBV (11 meninos, 4 meninas; idades, 4-19 anos), 19 imunocompetentes com EBV-seropositivos saudáveis (10 meninos, 9 meninas; idades, 1-19 anos), e 4 crianças seronegativas saudáveis (3 meninos, 1 menina; idades, 1-10 anos). Todos os sujeitos com IM apresentaram manifestações clínicas típicas (por exemplo, febre, amigdalite, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, disfunção hepática e linfocitose atípica). O diagnóstico de IM foi feito com base em achados sorológicos de anticorpo IgM para antígeno capsid viral (VCA) ou seroconversão de VCA IgG e/ou EA e anticorpo EBNA negativo. Foram recolhidas 22 amostras de sangue de 16 crianças com IM 8 dias a 8 meses após o início da doença (o sintoma inicial era febre em todos os doentes). A CAEBV foi diagnosticada pelos critérios de Rickinson . Crianças com CAEBV tiveram febre intermitente ou persistente por >16 meses, com hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, e/ou erupção cutânea. Os resultados laboratoriais mostraram níveis elevados de transaminase, anemia, trombocitopenia e/ou hipergamaglobulinemia policlonal. O exame sorológico revelou uma elevação acentuada dos títulos de anticorpos para VCA e EA. Foram excluídas a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana e doenças reumáticas. Nenhum indivíduo foi submetido a transplante ou teve terapia anticancerígena.

Amostras

Amostras de sangue periférico 2-mLeparinizado foram coletadas. As PBL foram isoladas por hipoclorofórmio ficol e lisadas com 0,15 μg/μL proteinase K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); o DNA foi extraído com precipitação de fenol-clorofórmio-etanol. O ADN extraído foi quantificado por espectrofotómetro, ajustado a 0,25 μg/μL ADN, e usado como modelo PCR.

SensibilidadePCR

ADNEBV foram de três fontes: Raji, contendo 50 cópias de EBV por célula; Akata, contendo 20 cópias por célula; e fragmentos clonados de BamHI-L, que foram misturados com ADN de células do sangue do cordão umbilical e utilizados como padrão positivo. Para determinar a sensibilidade do sistema PCR, diluições seriais de 10 vezes (10°-104 cópias de EBV) do DNA extraído foram submetidas a PCR.

PCR

A dupla PCR aninhada foi concebida para amplificar a região conservada codificando gp220 (dentro do fragmento de BamHI-L) . O par externo do primer amplifica um fragmento 302-bp, usando os oligonucleotídeos 5′-GCGAACTGGTGGACACACATGA e 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, correspondendo às posições 2870-3171 do B95-8 (GenBank M10593). O par interno amplifica um fragmento de 239-bp . A PCR foi realizada numa reacção 50-μL contendo 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0.5 μM de cada primer, 2.5 U de Taq DNA polimerase (Boehringer-Mannheim), e 4 μL de ADN de amostra. Os produtos amplificados foram executados com agarose a 2% e corados com brometo de etídeo, e foi usada a mancha sul para confirmar a especificidade usando o fragmento de BamHI-L como sonda . Cada reacção PCR foi feita em triplicado e incluiu o controlo negativo para excluir a contaminação cruzada. Para confirmar a especificidade da PCR, o ADN foi analisado a partir do vírus herpes simplex tipos 1 e 2, vírus varicella-zoster, citomegalovírus humano e herpesvírus humano-6 e -7. Nenhuma amplificação específica foi notada.

Quantificação do genoma EBV

A quantidade de ADN EBV no PBL foi determinada através de experiências de diluição limitada. Diluições série 10 vezes (1-10-6μg) de ADN genómico extraído de cada amostra de ADN foi submetido à PCR aninhada como descrito acima, e o limite mínimo para o resultado positivo foi convertido na carga viral (cópias/2,5 × 105 células).

Resultados

A sensibilidade do sistema PCR foi cuidadosamente determinada por diluições 10 vezes das três fontes de ADN EBV: Raji e Akata, ambas contendo números constantes de cópias de ADN EBV por célula, e o fragmento clonado de BamHI-L. Raji contém 50 cópias do genoma EBV por célula, e 1 μg de DNA genômico de células Raji é igual ao extraído de 2,5 × 105 células: portanto, 1,25 × 107 cópias de DNA EBV. O DNA do Raji foi diluído apropriadamente, e o DNA contendo 10n cópias (diluições em série de 10°-104 cópias do vírus) foi submetido a amplificação. Foi examinado o limite mínimo para um resultado positivo de PCR. Os exames repetidos revelaram que a sensibilidade era de 100 cópias por reacção com reprodutibilidade. Os resultados foram os mesmos usando ADN Akata e com a experiência de diluição usando 10n cópias de fragmentos de BamHI-L misturados com 105μg, 102μg, e sem ADN de células sanguíneas do cordão umbilical.

Todos os PBL de indivíduos com IM e CAEBV foram positivos para o genoma EBV. Nove (47%) de 19 amostras de pessoas saudáveis EBV-seropositivas foram positivas. Todas as PBL de pessoas seronegativas foram negativas.

ADN EBV em PBL foi quantificado e comparado para controles saudáveis EBV-seropositivos, crianças com IM e crianças com CAEBV (figura 1). Em crianças EBV-seropositivas saudáveis, as cargas de vírus foram de 100-1000 cópias por 2,5 × 105 PBL. Em PBL de crianças com IM, os limites mais baixos para resultados positivos de PCR variaram de 10° μg (2,5 × 105 PBL) a 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) de ADN genómico, indicando que a carga de vírus foi de 100-100.000 cópias/2,5 × 105 PBL. Três amostras de sangue coletadas dentro de um mês após o início da doença abrigaram cargas maiores (1000-100.000 cópias/2,5 × 105 PBL). O PBL coletado >11 meses após o início da IM tendia a conter quantidades menores do vírus. Nós seguimos as cargas de vírus em 4 pacientes IM (figura 2A). Em todos os 4, as cargas de vírus diminuíram durante a evolução clínica mas foram mais elevadas (100-10.000 cópias/2,5 × 105 PBL) do que nos hospedeiros saudáveis seropositivos.

O PBL de crianças com CAEBV tinha mais ADN EBV do que as amostras de crianças com IM. Quatro pacientes com CAEBV foram seguidos por >16 meses (figura 2B ilustra os achados para 2 pacientes). Dois outros pacientes tiveram cargas de vírus inalteradas durante 2-3 anos (105 e 106 cópias/2,5 × 105 PBL, respectivamente). Todos esses pacientes tiveram cargas de vírus persistentemente altas, ao contrário dos achados com MI. Quando examinamos a relação entre as manifestações clínicas e as cargas de EBV, apenas a febre estava correlacionada com a carga viral. Não houve correlação com hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, exantema, alergia a mosquitos, disfunção hepática, anemia, trombocitopenia ou títulos séricos de anticorpos contra VCA, EA-DR e EBNA.

Discussão

A PCR quantificando o ADN EBV demonstrou que o PBL de crianças com CAEBV ou IM tinha cargas elevadas de vírus, indicando replicação activa do EBV nos linfócitos. A replicação viral foi considerada mais ativa no CAEBV do que na IM; no grupo IM a replicação diminuiu gradualmente, enquanto a replicação ativa persistiu por anos nos pacientes com CAEBV.

O nosso sistema PCR amplifica sequências específicas do EBV codificando gp220, que é um gene de cópia única em um vírus, enquanto os estudos anteriores visavam a repetição interna longa localizada na região BamHI-W. Como na proliferação policlonal do EBV o número de repetição desta região é inconstante, o nosso sistema é considerado mais preciso para quantificar o EBV, embora menos sensível para a detecção. O defeito de baixa sensibilidade foi superado com o uso da PCR aninhada. A sensibilidade foi de 100 cópias por reacção, em comparação com 10 cópias no relatório anterior. Nós quantificamos os genomas EBV em PBL pela diluição em série do DNA extraído. Nosso sistema quantificando o DNA do EBV por diluições em série do DNA extraído mostrou-se reprodutível e confiável.

O PBL coletado de crianças com IM e com CAEBV abrigou maiores quantidades do genoma EBV do que o PBL de controles soropositivos saudáveis. Destes últimos, 47% tinham ADN EBV detectável (100-1000/2,5 × 105 PBL). O EBV em 2 indivíduos foi detectado em níveis superiores aos dos estudos anteriores (1-50/106 PBL) . Uma vez que estudámos crianças, os períodos mais curtos após a infecção primária podem contribuir para as cargas de EBV mais elevadas do que as observadas em estudos anteriores com adultos, lembrando-nos que, especialmente em crianças, os resultados positivos de PCR incluem infecção por EBV latente assintomática.

As crianças com IM tinham grandes quantidades de EBV. As cargas de EBV atingiram o seu pico um mês após o início (1000-100.000 cópias/2,5 × 105 PBL) e depois diminuíram gradualmente, mas permaneceram elevadas vários meses após o início (⩽8), em comparação com os níveis dos controlos saudáveis. Mesmo quando as manifestações clínicas desapareceram, os níveis relativamente altos de replicação do EBV continuaram no PBL.

Os pacientes com CAEBV tinham quantidades persistentemente grandes de EBV, sugerindo que a replicação ativa crônica não regulada do EBV no PBL resulta em doença grave com um prognóstico ruim. Os fatores e mecanismos que levam à replicação viral surpreendentemente ativa permanecem pouco claros. Foram descritas várias deficiências heterogéneas nos sistemas de defesa do hospedeiro, tanto da imunidade humoral como celular, que podem permitir a replicação viral activa. Uma elevada carga viral em PBL (>1300.000 EBV/105 PBL) foi demonstrada na doença linfoproliferativa pós-transplante associada ao EBV (DPT), uma complicação após transplantes, embora a carga viral tenha diminuído no espaço de um ano em paralelo com a recuperação da imunossupressão. Uma diferença quantitativa na carga circulante de EBV foi correlacionada com o nível de anticorpos EBNA no PTLD, mas não no CAEBV. Portanto, o comportamento do EBV no PTLD foi considerado similar e diferente do do CAEBV. Em vista das manifestações clínicas, o CAEBV parece semelhante à síndrome linfoproliferativa ligada ao X (XLP), para a qual o gene responsável foi recentemente identificado. No entanto, ao contrário da síndrome XLP, a CAEBV não é uma doença hereditária, e as fêmeas podem ser afectadas. Uma análise imunológica mais aprofundada da CAEBV é necessária para esclarecer fatores predisponentes para a ativação viral.

Aciclovir, interferon-α e interleucina-2 têm sido utilizados para tratar a CAEBV – com resultados insatisfatórios. Nossos resultados indicam que drogas citotóxicas que induzem imunossupressão e aumentam a ativação viral devem ser escolhidas cuidadosamente, embora as características clínicas sejam semelhantes às das neoplasias hematológicas malignas. A persistência de cargas elevadas de EBV em PBL é um possível critério diagnóstico para CAEBV e pode ser útil para monitorar a atividade da doença, para classificar a doença e para prever o prognóstico.

Acreditas

Agradecemos a George Klein (Microbiology and Tumorbiology Center, Karolinska Institute, Stockholm) pela revisão do manuscrito e a Sachi Takemoto e Ai Kitamura pela assistência técnica habilidosa.

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