Associação de mutações CFTR com PC idiopática em populações não-caucasianas

Como a fibrose cística é geralmente mais comum entre os caucasianos, é importante descobrir se mutações/polimorfismos CFTR estão associados com PC idiopática em pacientes não-caucasianos. Em um estudo japonês com 65 pacientes com PC, foi encontrada uma alta associação de p.Q1352H (12,3% em pacientes com PC vs. 3,7% em controles) e p.R1453W (6,2%v 3,1%), sugerindo uma associação de variantes de CFTR com PC no Japão onde a FC é muito rara (30). Neste estudo, nenhuma das mutações causadoras de FC comuns encontradas em populações caucasianas foi detectada. Muito recentemente, Nakano et al (63) relataram uma análise abrangente das variantes de CFTR em pacientes japoneses com PC por meio de sequenciamento de próxima geração. Eles encontraram 10 variantes não-sinônimas de CFTR (p.R31C, p.R31H, p.I125T, p.K411E, p.V470M, p.I556V, p.L957fs, p.L1156F, p.Q1352H, e p.R1453W) em pacientes com PC idiopática. A freqüência da variante p.L1156F foi maior em pacientes com PC idiopático do que nos controles (10/121 vs. 46/1136, P=0,033). Um relatório da Koreas mostrou que o haplótipo contendo p.Q1352H mostrou a mais forte associação com bronquiectasia e PC (P=0,02 e P=0,008, respectivamente) (48). Outro estudo do Japão (45) mostrou a associação das variantes de emenda 5T do trato politímido do intron 9 com o PC. Em um estudo da China, a ocorrência de alelos CFTR anormais foi encontrada três vezes mais frequente em pacientes com CP idiopática do que em controles (22/156 vs. 19/400, P <0.0001) (13). O alelo 5T foi associado com o início precoce da PC idiopática. O haplótipo contendo c.125G/c.1001+11C, (TG)12 repetições, p.470M, c.2694T e c.4521G haplótipo foi associado com um risco aumentado de PC idiopática (odds ratio 11.3; intervalo de confiança 95% 2.3-54.6, P=0.008) em pacientes chineses. Em um estudo de pacientes indianos com PC idiopático, encontramos que variantes menores de CFTR eram 5 vezes mais comuns quando comparadas com controles saudáveis e seis variantes novas c.2280G>A, c.2988+35A>T, c.3718-41C>G, c.473G>A, c.1680-99C>T, e c.1392+4G>T) foram detectados (58).

Mecanismo da mutação do gene CFTR e pancreatite

O(s) mecanismo(s) envolvido(s) na causa da pancreatite em pacientes com mutações CFTR menores não é(são) conhecido(s). Um estudo mostrou que o transporte do canal iônico, medido pelo cloreto de suor, e a diferença de potencial transepitelial nasal eram variáveis em pacientes com pancreatite com mutações CFTR menores, mas as medidas do canal iônico pioraram com o aumento do número e da gravidade das mutações CFTR (9). Outro estudo mostrou que houve transporte anormal de íons em pacientes com 2 mutações CFTR menores e pancreatite, o que sugeriu que quantitativamente a perda da função CFTR está entre a observada em pacientes com fibrose cística e em portadores normais (64). Um estudo recente mostrou que a mutação do CFTR p.M348V menor resultou na diminuição dos fluxos Cl- e HCO3- através da célula xenopus oocyst, sugerindo a possibilidade de defeito semelhante no pâncreas (88). Entretanto, se tal defeito putativo nos fluxos iônicos opera através da célula acinar ou das células ductais não é conhecido e como tal efeito leva ao início da pancreatite também não é compreendido. Não se sabe se resulta em uma concentração diferente de íons no suco pancreático dentro dos ductos devido ao defeito nas células ductais, o que então leva à precipitação de proteínas e obstrução ou se um defeito nas células acinares leva a perturbação no meio interno das células acinares resultando em perturbação na ativação ou secreção enzimática. Como a fibrose cística é uma doença associada a infecções bacterianas evidentes, estudos sobre o papel da flora intestinal na progressão da PC são justificados.

Em resumo, mutações maiores e menores no gene CFTR estão associadas à PC idiopática tanto em pacientes caucasianos como não caucasianos.

3. Inibidor da Protease Serina Kazal Tipo 1 (SPINK1) gene e pancreatite crónica idiopática

SPINK1 é uma proteína reagente de fase aguda. É um inibidor natural da protease e inibe a tripsina activa dentro das células acinares do pâncreas. Assim, proporciona protecção contra uma tripsina activada prematuramente nas células acinares. Em 2000, três importantes estudos relataram uma frequência significativamente maior da mutação do p.N34S no exon 3 do gene SPINK1 em pacientes com PC idiopática (17, 71, 93). Posteriormente, muitos outros estudos relataram mutações no gene SPINK1 em pacientes com PC idiopática de origem étnica diferente. Estudos da Índia mostraram que as mutações no gene SPINK1 eram bastante comuns em pacientes com PC idiopático (tropical) (7, 11). Além da mutação N34S, outra mutação p.P55S no gene SPINK1 também foi encontrada como sendo comum em pacientes com PC idiopático (23). Outras variantes raras incluem p.D50E, p.Y54H, p.R65Q, e p.R67C no gene SPINK1. Uma meta-análise recente de todos os estudos sobre a mutação SPINK1 em PC publicados até 2007 mostrou que essa mutação foi detectada em 469 de 4.842 alelos de pacientes e em 96 de 9.714 alelos de controle, produzindo uma razão de probabilidade combinada de 11,00 (95% C.I. 7,59-15,93) baseada na freqüência alélica para todas as etiologias de PC (2). A odds ratio foi maior para PC idiopático em comparação com a odds ratio para PC alcoólico. Uma lista abrangente dos estudos incluídos na meta-análise está disponível neste estudo (2).

Num estudo mais recente de pacientes chineses com PC idiopático de Taiwan, foi demonstrado que a mutação SPINK1 está associada a 32,4% dos pacientes com PC de início precoce e 2,1% dos pacientes com PC de início tardio (15). A mutação mais comum foi a variante intrônica IVS3+2T>C (c.194+2>C) e não a p.N34S como visto em outros estudos. A associação da IVS3+2T>C com PC foi relatada pela primeira vez em pacientes japoneses com PC (41). Este estudo mostrou uma clara distinção entre PC de início precoce e PC de início tardio em relação à mutação genética, sugerindo que a mutação leva a um início precoce e formas mais graves de pancreatite.

Na Coréia, mutações SPINK1, p.N34S e IVS3+2T>C foram identificadas em 3 e 11 dos 37 pacientes com PC idiopática, respectivamente, incluindo um com p.N34S/IVS3+2T>C heterozigoto. A prevalência da mutação SPINK1 IVS3+2T>C foi 26,8% em pacientes com PC idiopática (67).

Num estudo japonês, as frequências de p.N34S e IVS3+2T>C no gene SPINK1 foram significativamente maiores em pacientes com PC idiopática (10.6% e 11,6%, respectivamente) do que nos controles (0,4% e 0%) (54).

A maior freqüência de mutação do gene SPINK1 p.N34S foi relatada em pacientes indianos com PC idiopático. Dois estudos relataram que a mutação SPINK1 p.N34S esteve presente em 47% e 44% dos pacientes com PC idiopática (tropical) (7, 11, 58).

Mecanismo da mutação SPINK1 e pancreatite

O mecanismo de como a mutação SPINK1 p.N34S causa a PC não é bem compreendido (16). Um estudo mostrou que a mutação do p.N34S não estava associada a emendas alternativas (55). Dois outros estudos quase simultaneamente mostraram que os polimorfismos comuns do p.N34S e p.P55S envolvem substituições amino-ácidas com propriedades físico-químicas similares mas não causam qualquer redução significativa em termos de expressão do peptídeo maduro SPINK1 (10, 46). Por outro lado, a mutação IVS3+2T>C causou o salto de todo o exon 3, codificando a região na qual o local de ligação da tripsina está localizado. Isto leva tanto à produção de uma proteína mutante como à diminuição da expressão para 62% da observada no controle saudável nestes pacientes de PC (47). A mutação de falta de sentido p.R65Q envolve a substituição de um aminoácido carregado positivamente por um não carregado e causa uma redução de aproximadamente 60% da expressão da proteína (10). Outros polimorfismos raros p.G48E, p.D50E, p.Y54H, e p.R67C, envolvem aminoácidos carregados e levam à perda completa ou quase completa da expressão do SPINK1 possivelmente devido à retenção e degradação intracelular (46).

Em resumo, as mutações do gene SPINK1 particularmente o pN34S são mais comumente associadas à PC idiopática em pacientes com PC da Índia.

4. Mutações em outros genes e em CP idiopática

Desde que mutações no gene do tripsinogênio catiônico foram significativamente associadas com pancreatite hereditária, mutações no tripsinogênio aniônico também foram testadas em pacientes com CP. No entanto, verificou-se que o tripsinogénio aniónico (PRSS2) p.G191R pode realmente conferir protecção contra a PC em europeus. Contudo, o seu papel protector tem sido questionado noutras populações (52, 81).

Chymotrypsinogen C (CTRC) degrada o tripsinogénio e as suas variantes de perda de função têm sido encontradas em doentes europeus com PC. Em pacientes indianos e japoneses com PC idiopático, nenhuma associação significativa com variantes do CTRC foi encontrada inicialmente (21) mas uma variante única de perda de função p.R29Q foi identificada em pacientes japoneses e uma associação significativa foi mostrada para pacientes indianos com PC também (21, 57, 69).

Uma mutação no gene receptor de detecção de cálcio (CASR) foi sugerida para desempenhar um papel no PC idiopático em pacientes alemães (26). Em uma população americana também, o polimorfismo CASR exon 7 p.R990G foi significativamente associado ao PC (OR, 2.01; IC 95%, 1.12-3.59; P=0.015) (61). A associação entre R CAS p.R990G e PC foi mais forte em indivíduos que relataram consumo moderado ou pesado de álcool (OR, 3.12; IC 95%, 1.14-9.13; P=0.018). Também em pacientes indianos com PC idiopático (tropical), uma associação com a mutação do gene CASR foi observada (62).

Proteína de pedra pancreática (PSP) foi considerada como um componente protéico importante de pedras pancreáticas em PC. A PSP é uma proteína secretora de estresse (8). A PSP humana ou proteína Reg é codificada pelo gene reg1a (gene regenerador). Entretanto, polimorfismos no gene reg1a, incluindo as variantes reguladoras, não foram encontrados associados com o gene idiopático (tropical) CP (51).

Atividade da enzima conversora da angiotensina (ACE) pode estar relacionada com a ativação de células esteladas pancreáticas e fibrose pancreática. Entretanto, não foram encontradas diferenças significativas na prevalência das frequências do genótipo de depleção da ECA quando pacientes com alcoolismo (27,5%), não alcoolismo (26,4%) e pancreatite aguda (32,7%) foram comparados com controles (26,9%) em um estudo europeu recente (39).

O gene HFE é um fator de risco importante para hemocromatose hereditária, mas não se sabe se ele pode aumentar a suscetibilidade à PC. Não foram encontradas diferenças significativas na heterozigosidade para p.C282Y e p.H63D entre pacientes com alcoolismo (8,0, 21,5%), idiopatia (7,3, 24,5%) ou pancreatite familiar (9,8, 23,0%), ou adenocarcinoma pancreático (5.4, 28,6%) e saudáveis (6,2, 24,8%) e alcoólicos (7,0, 25,0%) em um estudo recente (38).

Em um estudo de Taiwan, o polimorfismo do gene TNF-alfa foi mostrado como um fator de risco para PC. O alelo 2863A do promotor TNF-alfa foi associado a um risco aumentado para PC (odds ratio 4,949 (95% CI 2,678-9,035)). Na análise multivariada, 2863A e 21031C foram associados independentemente com maior suscetibilidade à PC (P<0,0001) (12).

5. Genome Wide Association Studies

Foi reconhecido que as investigações conduzidas por hipóteses podem levar muito tempo e ainda não produzir resultados satisfatórios. Assim, em doenças poligênicas mais complexas como a PC, múltiplos genes contribuem para a patogênese através de mudanças quantitativas e não qualitativas. Assim, uma abordagem independente de hipóteses através de estudos de associação ampla do genoma (GWAS) foi iniciada para encontrar genes que influenciam o risco de doença através do GWAS (36). Aplicando a abordagem GWAS, Whitcomb et al identificaram dois loci em PRSS1-PRSS2 e CLDN2 ligado ao X sendo robustamente associado com pancreatite aguda recorrente e PC relacionada ao álcool em indivíduos de ascendência europeia (91). Estudos posteriores confirmaram a associação desses loci com PC idiopática em pacientes de diferentes ancestralidades, ou seja, chineses, europeus, japoneses e indianos (20, 33, 56, 85).Muito recentemente, outro estudo de associação genómica mostrou uma nova associação entre PC alcoólico e polimorfismos nos genes que codificam a fucosiltransferase 2 sem estatuto de não-secreção (FUT2 locus rs632111 e rs601338) e grupo sanguíneo B (ABO locus rs8176693) (86).

A pancreatite crónica idiopática é uma doença genética?

Num estudo de 381 pacientes com CP, 32% tinham 166 alelos CFTR mutantes, incluindo 12 novas variantes CFTR: c.4243-20A>G4375-20 A>G, p.F575Y, p.K598E, p.L1260P, p.G194R, p.F834L, p.S573C, c.2657+17C>T2789 + 17 C>T, 621+83 A>G, p.T164S, c.489+25A>G 621+25 A>G, e c.3368-19G>A3500-19 G>A… A mutação SPINK1 foi observada em 14,5% (55/381) e a mutação PRSS1 esteve presente em 8,1% (31/381) dos pacientes (42). Assim, 49% (185/381) dos pacientes sofreram uma ou mais mutações. Em 242 pacientes indianos com PC idiopático, até 66% dos pacientes tinham ou SPINK1 ou CFTR ou ambas as mutações (58). Estas observações dão forte apoio ao conceito de que a maioria dos casos de PC idiopática tem uma predisposição genética subjacente. No entanto, além disso, devem existir influências ambientais que modulem a apresentação aberta e o fenótipo da doença. Assim, parece que o termo “PC idiopático” pode não ser mais justificado e um termo mais significativo como “CP-G” é proposto onde “G” denota susceptibilidade genética.

6. Mutações genéticas/polimorfismos e Pancreatite Alcoólica

A descoberta de uma variedade de mutações genéticas em PC idiopático e hereditário pensou-se que o mesmo poderia ser válido para PC relacionado ao álcool. Entretanto, ao contrário da PC idiopática, mutações genéticas nos genes geralmente suspeitos, ou seja, SPINK1, PRSS1, e CFTR não foram encontradas comumente nos pacientes com PC alcoólico.

Um estudo em pacientes europeus não encontrou nenhuma associação significativa com nenhum dos 3 genes, ou seja, CFTR, PRSS1, e SPINK1 (70). Tanto o CFTR quanto as mutações do tripsinogênio catiônico não foram encontrados como fatores de risco predisponentes para pancreatite relacionada ao álcool em um estudo dos EUA (60). As mutações CFTR não parecem ter um papel importante na PC alcoólica (89). Da mesma forma, um estudo dos EUA também não encontrou a mutação SPINK1 p.N34S mais comumente em PC alcoólica que em controles (6,3%, vs. 1,1% controles; P>0,05) (76). Estudos de outras partes do mundo também relataram resultados similares. Um estudo da Coréia não encontrou associação de pancreatite alcoólica crônica com mutações do gene CFTR ou SPINK1 (49).

Polimorfismos nos loci conhecidos no TNF-alfa, TGF-beta(1), IL-10, IFN-gamma genes que estão envolvidos na inflamação não foram encontrados associados à PC alcoólica (73). Inicialmente pensou-se que a proteína associada à pancreatite (PAP) poderia estar envolvida na patogênese da PC. Entretanto, não houve evidências de polimorfismo do gene PAP em pacientes com pancreatite alcoólica (43).

Polimorfismos dos genes relacionados ao metabolismo dos compostos oxidantes, como NADPH-quinone oxidoreductase 2 (NQO2), multirresistência a drogas 1 (MDR1) e lipoproteína lipase (LPL), foram analisados na PC alcoólica. Entretanto, não foi encontrada diferença significativa entre pacientes e controles em relação a esses genes (53). Da mesma forma, polimorfismos em outras enzimas metabolizadoras, como a glutathione-S-transferase P1 (GSTP1) e a manganese-superóxido dismutase (MnSOD), e enzimas desintoxicantes de biotransformação fase II, como as UDP-glucuronosiltransferases, não foram encontradas associadas à suscetibilidade à PC alcoólica (68, 83). Entretanto, um estudo mostrou associação significativa com UDP-glucuronosiltransferases e PC com risco aumentado com o alelo UGT1A7*3 (K129-K131-R208) (OR, 1,76; IC 95%, 1,26-2,46; P=0,0009). Além disso, o alelo UGT1A7*3 foi especificamente associado ao subgrupo de pacientes com pancreatite alcoólica, dos quais 89% eram fumantes (OR, 2,24; IC 95%, 1,46-3,43; P = 0,0001) (65).

Polimorfismos na proteína quimiotática monocitária-1 (MCP-1) e proteína de choque térmico 70-2 (HSP70-2) também não foram encontrados associados à PC alcoólica (50).

Desde que o álcool é considerado como causador de lesão tóxica ao pâncreas, os polimorfismos nas enzimas metabolizadoras do álcool têm sido estudados como base da susceptibilidade individual ao desenvolvimento de pancreatite. No gene da álcool desidrogenase 1B (ADH1B), a frequência de alelos do tipo selvagem ADH1B*1 foi significativamente menor no PC alcoólico em comparação com os alcoólicos sem PC (35). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos paciente e controle nos genótipos da enzima aldeído desidrogenase ADH2. Mas uma diferença significativa foi encontrada entre os dois grupos na enzima acetaldeído desidrogenase ALDH2 locus em outro estudo (44). A frequência do alelo do tipo selvagem ALDH2*1 foi encontrada em 0,681 e a do alelo ALDH2*2 (p.E504K) foi de 0,319 nos controles, enquanto estes valores foram de 0,935 e 0,065 nos pacientes, respectivamente . A maioria dos pacientes (27 de 31) eram ALDH2*1/*1, apenas quatro eram ALDH2*1/*2 e nenhum paciente era ALDH2*2/*2. Assim, o polimorfismo genético do gene ALDH2 pode influenciar o risco de desenvolvimento de pancreatite alcoólica (44). Em outro estudo, as freqüências dos genótipos ADH3 e CYP2E1 c1c2 não diferiram entre pacientes com PC, alcoólatras e controles saudáveis (84). Em um estudo polonês, os genótipos ADH2*1, ADH3*1 e ADH2*1/*1, ADH3*1/*1 foram estatisticamente mais frequentes entre os pacientes com PC alcoólico do que entre os controles (18). Em outro estudo da Austrália, cirrose alcoólica mas não PC alcoólica foi associada ao ADH3*2/*2 e talvez ao ADH2*1/*1 (28). Assim, há relatos contraditórios e variáveis e os dados até o momento não sugerem nenhuma associação definitiva de polimorfismos em enzimas metabolizadoras ou desintoxicantes do álcool.

7. Mutações genéticas em outros tipos de pancreatite crônica

Algumas das causas específicas de PC estão relacionadas a desarranjos metabólicos ou defeitos anatômicos e geralmente acredita-se que essas anormalidades sejam a única causa de pancreatite. Entretanto, estudos recentes trouxeram o papel da predisposição genética em tais pacientes.

Em um estudo de pacientes com hiperparatiteoidismo primário, 4 (16%) dos 25 pacientes com pancreatite portaram a mutação do p.N34S no gene SPINK1, enquanto todos os 50 controles (hiperparatiteoidismo sem pancreatite) não mostraram mutação nos genes SPINK1 ou PRSS1 (P < 0,05 vs. controles, P < 0,001 vs. população geral) (25). Além disso, mutações CFTR estavam presentes em quatro pacientes (P < 0.05 vs. população geral), enquanto um paciente carregava um alelo 5T. Um paciente era transheterozigótico (SPINK1: p.N34S/CFTR: p.R553X). É importante ressaltar que a média dos níveis séricos de cálcio em pacientes com pancreatite não diferiu significativamente da média dos pacientes sem pancreatite, questionando assim o valor dos níveis séricos de cálcio na causa ou início da pancreatite. Os autores concluíram que as mutações genéticas aumentaram significativamente o risco de pancreatite em pacientes com hiperparatiteroidismo.

Na PC relacionada à hipertrigliceridemia (HTG), Chang et al (14) mostraram uma maior frequência de mutações do gene CFTR sugerindo que o mecanismo da pancreatite pode estar relacionado à predisposição genética. Em seu estudo de 126 pacientes com HTG, 13 (10,3%) portaram uma mutação do gene CFTR (todos foram p.I556V), a taxa de mutação do gene CFTR foi significativamente mais alta naqueles com que não houve pancreatite (26,1% (12 de 46) vs. 1,3% (1 de 80); P <0,0001). Uma análise multivariada dos pacientes com HTG indicou que triglicérides, CFTR 470Val e TNF promotor 863A foram marcadores de risco independentes para pancreatite associada ao HTG.

Existe considerável controvérsia se o pancreas divisum causa ou não pancreatite recorrente (72). Em pacientes com pâncreas divisum apresentando pancreatite recorrente, um estudo mostrou diferença de potencial transepitélio nasal inferior sugerindo um defeito funcional no gene CFTR para contabilizar o risco de pancreatite no pâncreas divisum (32). Outro relato de caso mostrou a presença de mutações menores do CFTR em 2 pacientes com DP apresentando pancreatite recorrente (22). Outro estudo mostrou que as mutações do gene SPINK1 estavam significativamente associadas ao pâncreas divisum associado à pancreatite, em comparação com os controles. As mutações SPINK1 estavam presentes em 38% dos pacientes com pâncreas divisum e pancreatite recorrente em comparação com 2% nos controles saudáveis sugerindo que é improvável que o pâncreas divisum sozinho cause pancreatite e que a pancreatite pode ser resultado tanto da predisposição genética quanto de defeito anatômico, uma teoria de 2 acertos (31).

Mutação genética não associada à CP

Polimorfismos na região promotora do fator de necrose tumoral (TNF) e toda a região codificadora do receptor TNF 1 (TNFR1) correspondente não foram associados à CP hereditária, familiar ou idiopática (77).

Polimorfismos funcionais no gene fator de crescimento transformador-beta1, gene interleucina-10, e no gene interferon-gama não foram encontrados associados com pancreatite hereditária, familiar ou esporádica (74).

Mutação nos genes que codificam a glutationa s-transferases – MGST1, e genes GSTM3 ou deleções comuns nos genes GSTT1 e GSTM1 também não foram associados com pancreatite hereditária (78).

Mutação do gene queratina 8 não foi encontrada associada com PC hereditária ou idiopática (75).

8. Perspectivas futuras

Embora tenha havido ganho significativo em nosso entendimento da predisposição genética em pacientes com PC, existem lacunas igualmente significativas em nosso conhecimento. Assim, as mutações genéticas actualmente conhecidas estão associadas a 50-60% dos casos em PC idiopático (42, 58). Além disso, o papel causal da mutação genética no início e progressão da pancreatite também não é claro. Por exemplo, a mutação SPINK1 p.N34S, que é a mutação mais comumente relatada em pacientes com PC, não resulta em nenhuma perda funcional da atividade enzimática. Como isto leva à pancreatite é desconhecido. Se é apenas um espectador ou modificador e não a mutação causal permanece por determinar. Na pancreatite relacionada com o álcool, não se sabe porque apenas <5-10% dos alcoólicos desenvolvem pancreatite. A predisposição genética para pancreatite relacionada ao álcool não produziu, até agora, muitas informações.

O modesto efeito da variação comum, a base da atual tecnologia de triagem de GWAS, sobre muitas doenças humanas, bem como traços relacionados, está desviando o interesse para estudos sobre variantes mais raras com maiores efeitos sobre o resultado de doenças. Assim, a seleção rigorosa dos fenótipos clínicos e a priorização de coortes menores de pacientes para seqüenciamento direto do genoma inteiro pode ser a melhor solução para identificar variantes causais putativas.