Desenho do estudo

Neste estudo randomizado de dois braços, duplo-cego, vamos recrutar 60 mulheres grávidas com idades entre 19-42 anos a viver em Vancouver, BC, Canadá. As participantes serão aleatorizadas para suplementar diariamente durante 16 semanas com 0,6 mg/dia de ácido fólico ou uma dose equimolar (0,625 mg/dia) de ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico (Fig. 2). A dose de 0,6-mg irá corresponder aos níveis encontrados nas principais marcas comerciais de vitaminas pré-natais (Materna®), aumentando assim a generalização dos nossos resultados. A intervenção de 16 semanas foi baseada na meia-vida estimada do folato nas hemácias e pretende permitir a medição do estado de folato a longo prazo nas hemácias (últimas 12-16 semanas). Todos os participantes também receberão uma multivitamina pré-natal sem folato, para garantir a adequação de outros nutrientes (por exemplo, ferro) durante a gravidez. Amostras de sangue venoso em jejum serão coletadas na linha de base e na linha vermelha para medir os resultados primários, incluindo folato sérico, folato nas hemácias e UMFA plasmática; as medidas exploratórias incluirão S-adenosil-metionina plasmática, S-adenosil-homocisteína, homocisteína total, cisteína total, metionina, vitamina B12, piridoxal-5-fosfato, colina livre e betaína. Genotipagem das variantes MTHFR (677 C > T, rs1801133, e 1298 A > C, rs1801131) e DHFR (rs1643649 e rs70991108) e um hemograma completo também será determinado. As mulheres terão a opção de continuar na fase pós-parto (exploratória) do estudo, onde em sua visita endline receberão mais suplementos para tomar até aproximadamente 1 semana pós-parto. Nos dias 5-7 pós-parto, as mulheres fornecerão uma pequena amostra de leite materno (3 ml) e uma amostra de sangue venoso sem jejum. Os resultados avaliados no leite materno incluirão formas folatadas (UMFA, THF, 5-methyl-THF, 5-formyl-THF e 5,10-methenyl-THF) e leite FBP. Os resultados avaliados na amostra de sangue pós-parto incluirão folato de hemácias e UMFA de plasma. O protocolo do estudo foi desenvolvido de acordo com os itens do protocolo padrão de 2013: Recomendação para Ensaios Intervencionistas (SPIRIT) (Fig. 3) . Veja o arquivo adicional 1 (Lista de verificação SPIRIT) para mais detalhes.

Diagrama de fluxo dos participantes

Itens do Protocolo Padrão: Recomendação para o cronograma de inscrições, intervenções e avaliações de Ensaios Intervencionistas (SPIRIT)

O objetivo principal deste estudo piloto é obter estimativas para a mudança no folato sérico, folato nas hemácias e UMFA após a suplementação com ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico e ácido fólico durante 16 semanas de gravidez para informar o desenho de um ensaio definitivo com potência adequada. O objetivo secundário é obter taxas de recrutamento e participação para auxiliar no desenho e viabilidade de um estudo definitivo. Os objetivos exploratórios da fase pós-parto são quantificar a proporção de folato mamário total como ácido fólico em cada grupo, avaliar a correlação entre UMFA plasmático materno pós-parto e ácido fólico mamário, e avaliar as concentrações de folato nas hemácias após o parto em cada grupo.

Participantes, recrutamento e consentimento livre e esclarecido

Critérios de inclusão: (1) gestante (gravidez de solteiro); (2) residente na área da grande Vancouver; (3) ≤ 21 semanas de gestação no momento do consentimento; (4) 19-42 anos de idade; e (5) capaz de fornecer consentimento livre e esclarecido.

Critérios de exclusão: (1) condições médicas pré-existentes conhecidas que têm impacto sobre o estado do folato materno (doenças malabsortivas e inflamatórias intestinais, doença celíaca ativa, cirurgia de bypass gástrico, gastrite atrófica, epilepsia, doença hepática avançada, diálise renal, diabetes mellitus tipo 1 ou 2, traço falciforme/anemia) ; (2) fatores de estilo de vida conhecidos pelo impacto do estado do folato materno (tabagismo atual, consumo de álcool, uso de drogas recreativas); (3) sendo de risco médio a alto para o desenvolvimento de uma gravidez afetada por DNT (aplica-se a mulheres ou a seu parceiro masculino: história pessoal ou familiar (pais ou irmãos) de outras anomalias congênitas sensíveis ao folato, história pessoal de TND ou uma gravidez anterior afetada por TND) ; (4) medicamentos conhecidos por interferir com o metabolismo das vitaminas B (cloranfenicol, metotrexato, metformina, sulfasalazina, fenobarbital, fenitoína, primidona, triamtereno, barbitúricos); (5) índice de massa corporal (IMC) antes da gravidez ≥ 30 kg/m2; ou (6) alergia a qualquer ingrediente de suplemento de estudo.

tamanho da amostra

O tamanho da amostra foi calculado com base no objetivo primário de estimar a distribuição (média ± desvio padrão) da mudança nos resultados primários (folato sérico, folato nas hemácias e UMFA) após 16 semanas de suplementação. Para isso, serão necessárias 50 mulheres (25 em cada grupo); uma amostra de pelo menos n = 50 é geralmente reconhecida como adequada para estudos-piloto de pesquisa clínica. Uma inflação de 20% será adicionada para contabilizar as participantes desistentes ou perdas para acompanhamento; assim, um total de 60 mulheres (30 em cada grupo) serão recrutadas.

Recrutamento

Posters serão exibidos no Hospital da Mulher de BC, em clínicas médicas e pré-natais e em estabelecimentos de varejo para mulheres grávidas (por exemplo, aulas pré-natais, estúdios de fitness, lojas de roupas maternas) em toda Vancouver, BC, Canadá. Os detalhes dos estudos serão compartilhados com o pessoal e profissionais de saúde, incluindo médicos, parteiras, enfermeiras e outros, conforme aplicável. Publicidade nas redes sociais (Facebook e Instagram) será usada e direcionada para mulheres grávidas de 19-42 anos na grande Vancouver, BC área.

Obtendo consentimento informado e confirmando elegibilidade

As mulheres interessadas em participar entrarão em contato diretamente com o coordenador de pesquisa (CMK). Neste momento, detalhes do estudo, elegibilidade e consentimento livre e esclarecido serão descritos. Os participantes elegíveis que gostariam de ser inscritos receberão uma identificação do estudo e a sua visita de base será agendada. Os participantes serão instruídos a continuar qualquer suplemento pré-natal atual de multivitaminas/folatos até sua visita de linha de base. A fase opcional pós-parto do estudo será descrita no termo de consentimento livre e esclarecido; entretanto, os participantes que optarem por continuar após as 16 semanas primárias receberão um termo de consentimento separado para assinar.

Visitas de estudo

Visitas de estudo serão facilitadas em Vancouver, BC, Canadá na Universidade de British Columbia, Food, Nutrition and Health Building e na Unidade de Avaliação de Pesquisa Clínica no Hospital da Criança e da Mulher da BC. Linha de base (8-21 semanas de gestação): Tanto o participante quanto o coordenador da pesquisa (CMK) assinarão o termo de consentimento livre e esclarecido; uma cópia será escaneada e enviada por e-mail ao participante após a visita ao estudo. Os participantes completarão um questionário de base para recolher o histórico médico e nutricional e dados demográficos. Um questionário de frequência alimentar validado será utilizado para calcular as DFEs . O peso e a altura serão tomados usando uma balança eletrônica e um estadiômetro e registrados a 0,1 kg e 0,10 m, respectivamente. Será colhida uma amostra de sangue venoso de 12 ml, em jejum de 3 horas. Os participantes receberão seus suplementos de estudo (ácido fólico ou ácido (6S)-5-metiltetra-hidrofólico) e serão fornecidos com um diário de suplementos para registrar a ingestão diária. Ponto médio: após 8 semanas, todas as mulheres serão contatadas para verificar a conformidade, responder a quaisquer perguntas ou preocupações, e agendar uma visita telefônica. Linha final (24-37 semanas de gestação): uma amostra de sangue venoso de 12 ml, 3 horas de jejum será coletada, o peso será medido conforme descrito acima e as participantes completarão um questionário endline para determinar quaisquer mudanças no estado de saúde ou uso de medicamentos desde a linha de base. Os participantes devolverão a sua agenda de suplementos e todas as cápsulas restantes serão contadas. Pós-parto: na visita endline, os participantes que estão a planear amamentar e que têm um congelador doméstico em funcionamento podem continuar na fase pós-parto do estudo. Uma vez obtido o consentimento usando um segundo termo de consentimento livre e esclarecido, eles receberão suplementos para continuar tomando até aproximadamente 1 semana pós-parto e um novo diário de suplementos. Os participantes serão treinados sobre como recolher uma pequena amostra (3 ml) de leite materno em sua casa nos dias 5-7 pós-parto e receberão todos os suprimentos necessários (descritos com mais detalhes na seção “Recolha e processamento do leite materno” abaixo). Os participantes guardarão a sua amostra de leite materno no congelador e notificarão o coordenador de pesquisa quando este estiver pronto para a recolha. A coleta ocorrerá no prazo de 4 dias após a notificação e uma amostra de sangue venoso de 12 ml será colhida nesse momento. As mulheres serão instruídas a tomar o suplemento de folato 2 h antes da coleta das amostras de leite materno e sangue, a fim de padronizar o pico de UMFA plasmático (e potencialmente a absorção de UMFA no leite materno; entretanto, o tempo deste processo não está bem descrito).

Acessórios de estudo

O ácido fólico e o ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico serão fornecidos separadamente das multivitaminas pré-natais. Esta decisão foi tomada porque algumas mulheres relatam intolerância ao consumo de multivitaminas pré-natais; isto é normalmente devido ao alto teor de ferro e se resolve após o primeiro trimestre. Caso surja intolerância temporária, as participantes podem saltar ou tomar meia dose dos seus multivitamínicos, enquanto continuam a suplementar com a dose completa de folato. Os ingredientes a granel para o ácido fólico e multivitaminas pré-natais foram fornecidos por Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá). O ácido a granel (6S)-5-metiltetrahidrofólico (Metafolin®) foi fornecido pela Merck & Cie (Schaffhausen, Suíça). Todos os ingredientes a granel foram compostos em cápsulas de gel vegetal na Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá). As cápsulas de ácido fólico e (6S)-5-metiltetrahidrofólico são idênticas na aparência para acomodar o duplo-cego. O multivitamínico pré-natal contém a mesma formulação de micronutrientes que a WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), exceto que o ácido fólico foi removido. Um resumo geral de qualidade foi completado para todos os suplementos de estudo por Factores Naturais (Coquitlam, BC, Canadá) e verificado pela Health Canada, com confirmação de ácido fólico e (6S)-5-metiltetra-hidrofólico doses através de cromatografia líquida de alta performance. Um aviso de autorização para o pedido de autorização de ensaios clínicos (Submission No. 244456) foi fornecido pela diretoria de produtos naturais e não sujeitos a receita médica da Health Canada em 26 de julho de 2019.

Double-blinding, randomization and provision of supplement packs

Um assistente de pesquisa independente da Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá) atribuirá códigos de cegueira (A ou B) aos suplementos de ácido fólico e (6S)-5-metiltetrahidrofólico. As garrafas de suplementos de folato serão rotuladas com “A” ou “B” e indicarão que “as cápsulas ou são ácido fólico ou folato”. Tanto os participantes quanto a equipe de pesquisa primária serão cegos para as alocações de suplementos, que serão descodificados somente quando as análises estatísticas finais forem concluídas. A sequência de randomização será gerada por computador por um estatístico independente, usando blocos de quatro, cada um contendo dois participantes por grupo de suplemento. A equipe de pesquisa primária será cega para a sequência de aleatorização. Na visita de base de cada participante, o coordenador da pesquisa (CMK) irá desobstruir a alocação (A ou B) para esse ID de estudo apenas para fornecer os suplementos de estudo alocados. Na linha de base, os participantes receberão um pacote de suplementos contendo todas as cápsulas para a intervenção de 16 semanas; se os participantes optarem por continuar para a fase pós-parto do estudo, eles receberão mais suplementos em sua visita endline para continuar a tomar até ~ 1 semana pós-parto.

Medicamentos concomitantes

Nova inscrição, não haverá restrições na ingestão de medicamentos durante todo o período de intervenção; no entanto, todos os medicamentos devem ser relatados. A única exceção será suplementos nutricionais contendo folato/folic-ácido, que não serão permitidos durante todo o período de intervenção.

Estratégias para aumentar a aderência

As mulheres grávidas tendem a ser altamente motivadas e geralmente estão interessadas em participar de ensaios clínicos de pesquisa . Segundo uma pesquisa da Agência de Saúde Pública do Canadá, 94% das mulheres na Colômbia Britânica suplementam com multivitaminas pré-natais durante a gravidez . Portanto, as participantes provavelmente estarão acostumadas à suplementação diária quando se inscreverem. O coordenador da pesquisa (CMK) entrará em contato com cada participante no meio do período (8 semanas após sua visita à linha de base) para responder a quaisquer perguntas ou preocupações. Além disso, o pacote de suplementos permitirá o armazenamento organizado de suplementos em casa e a agenda de suplementos servirá como um lembrete diário para aumentar a aderência ao longo das 16 semanas. Por estas razões, antecipamos uma alta aderência (> 90%) ao protocolo de estudo.

Recolha e processamento de amostras de sangue

Amostras de sangue venoso (12 mL total) serão coletadas em um tubo de ácido etilenodiaminotetracético de 6 ml

(EDTA), um tubo EDTA de 2 ml e um tubo sérico de 4 ml (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) nas visitas de linha de base, linha de fundo e pós-parto (se aplicável). A coleta de sangue na linha de base e na linha vermelha ocorrerá após um jejum de 3 horas; este período de tempo é suficiente para reduzir a influência confusa da ingestão recente de folato nas concentrações séricas. A amostra de sangue pós-parto (~ 1 semana pós-parto) será sem jejum, pois isso não influenciará o folato das hemácias e reduzirá a carga sobre os participantes. Após a coleta, os tubos serão protegidos da luz, invertidos suavemente conforme as recomendações do fabricante, colocados em um refrigerador e transportados para o laboratório para processamento imediato (dentro de 2 h após a coleta).

Para a preparação de hemolisato de sangue total, o sangue total (0,3 mL) será removido do tubo EDTA de 6 ml e diluído 1/11 pela adição de 3,0 mL de uma solução de ácido ascórbico a 1% e posteriormente incubado a 37 °C por 30 min. O tubo EDTA de 6 ml será então centrifugado a 3000 rpm durante 15 min a 4 °C. O plasma será coletado e (apenas para amostras de linha de base e linha de fundo) o conteúdo restante do tubo EDTA de 6 ml será processado para isolamento de células da camada mononuclear do sangue periférico (PBMCs) com o protocolo de isolamento SepMate PBMC (STEMCELLL Technologies, Vancouver, BC, Canadá). O tubo EDTA de 2 ml será usado para um hemograma completo. O tubo de soro de 4 ml será deixado à temperatura ambiente durante ~ 30 min (até à coagulação) e depois centrifugado a 3000 rpm durante 15 min a 4 °C; o soro será colhido. Todas as alíquotas serão armazenadas a – 80 °C até uma análise mais aprofundada.

Recolha e processamento do leite materno

As mulheres serão instruídas a recolher o leite materno nos dias 5-7 pós-parto entre 13:00 e 14:50 (como a concentração média de folato durante este tempo parece ser representativa da concentração média de folato durante um período de 24 horas) , 2-3 h após a sua última expressão completa. Os participantes expressarão completamente o leite materno (manualmente ou por bomba eléctrica) a partir do seio direito. Assim que o leite materno for expresso, as mulheres serão instruídas a girar suavemente o leite para misturá-lo, e então, usando uma pipeta falcão estéril, elas transferirão 0.5 mL em dois crioviais âmbar (cada um contendo 0.005 g de ácido ascórbico para uma diluição de 1%) e 1 mL em dois crioviais âmbar. Todos os cristais serão claramente marcados nos níveis 0.5- e 1-mL. As mulheres colocarão todos os frascos em uma caixa de congelamento que será armazenada no congelador por até 4 dias. As amostras serão recolhidas congeladas e transferidas para o laboratório para armazenamento a – 80 °C até nova análise.

Análises laboratoriais

Folato de soro (nmol/L) e folato de hemácias (nmol/L) serão analisadas por ensaio microbiológico, como globalmente recomendado, usando o método de microplaca de microtitulação descrito por Molloy et.al . Folato de hemácias (nmol/L) será calculado com a seguinte fórmula :

Plasma biomarkers incluindo UMFA (nmol/L), S-adenosil-metionina (μmol/L), S-adenosyl homocysteine (μmol/L), homocisteína total (μmol/L), cisteína total (μmol/L), metionina (μmol/L), colina livre (μmol/L) e betaína (μmol/L) serão analisadas por espectrometria de massa por cromatografia líquida. A vitamina B12 (pmol/L) será analisada por meio de um imunoanalisador. Pyridoxal-5-fosfato (nmol/L) será analisado por cromatografia líquida – espectrometria de massa tandem . As variantes gênicas serão genotipadas através de ensaios de genotipagem TaqMan SNP . Um hemograma completo será realizado utilizando um analisador hematológico automático (Sysmex XNL-550). As formas de folato de leite materno (incluindo UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF e 5,10-metenil-THF) serão quantificadas por cromatografia líquida espectrometria de massa tandem; o folato total representará a soma destas formas . As concentrações de FBP do leite materno serão medidas utilizando um procedimento de radioensaio de ligação competitiva (como descrito por Selhub et al.) .

Resumo dos dados a serem coletados

Dados demográficos, médicos e nutricionais através de questionários estruturados

A coleta de dados básicos incluirá idade, etnia, paridade, escolaridade, ocupação, renda familiar, histórico médico e medicamentoso, peso relatado antes da gravidez, dieta geral (incluindo dieta vegana, vegetariana, cetogênica, sem glúten e qualquer alimento/grupo alimentar evitado por qualquer razão) e uso de suplementos. A coleta de dados finais incluirá quaisquer alterações na saúde geral ou no uso de medicamentos desde a visita inicial.

Anthropometrics

IMC pré-gravidez será calculado usando o peso de pré-gravidez auto-reportado e altura medida. As medições dos participantes serão feitas na linha de base (peso e altura) e na linha de base (peso apenas) para o cálculo do ganho de peso gestacional ao longo do período de intervenção e do ganho de peso total ao longo da gravidez (usando o peso na pré-gravidez auto-reportado e o peso na linha de base medido).

Avaliação dietética

Total DFEs (μg/dia) de folatos alimentares e ácido fólico suplementar serão calculados usando o Bloco Ácido Fólico/Equivalente de Folato (NutritionQuest, Berkeley, CA, EUA), um questionário de frequência alimentar validado.

Dados pós-parto

Semanas totais de suplemento, semanas de gestação no parto, cumprimento do protocolo de colheita de leite materno e tempo de suplementação com folato antes da colheita de leite materno e amostras de sangue pós-parto serão registados.

Critérios de retirada

Critérios de retirada incluem interrupção espontânea ou planejada da gravidez, uso de suplementos nutricionais adicionais contendo folato/folic-ácido e após um evento adverso/seriamente adverso associado com os suplementos/intervenção experimental (conforme determinado pelo investigador qualificado (CM)). Os participantes também podem retirar-se a qualquer momento e não serão recolhidas mais informações. Independentemente do motivo da retirada, todos os dados previamente recolhidos serão retidos para análise. Os participantes que derem à luz antes da sua visita à linha telefónica terão a opção de continuar na fase pós-parto do estudo, dado que continuam a suplementar diariamente com os suplementos do estudo.

Manuseamento de dados e privacidade

Todos os dados e amostras biológicas serão identificados usando o ID do estudo de cada participante. Os dados com identificadores pessoais serão armazenados em um computador criptografado, protegido por senha, em um espaço seguro no servidor do BC Children’s Hospital Research Institute. Os dados com identificadores pessoais desvinculados serão limpos e a entrada dupla será completada pelo coordenador de pesquisa (KMC) e por um assistente de pesquisa independente no REDCap (Research Electronic Data Capture) hospedado pelo BC Children’s Hospital Research Institute. O KMC, JAH e CDK terão acesso ao conjunto de dados final. Os documentos em papel serão armazenados em um gabinete de arquivamento trancado e as amostras biológicas serão armazenadas em um freezer trancado dentro do laboratório principal do investigador (CDK) na Universidade de British Columbia. Os participantes podem ser informados da alocação de suplementos foliares e dos resultados de sangue/leite materno (se aplicável) (incluindo EEDs, soro e folato de hemácias na linha de base, linha vermelha e pós-parto, e concentrações totais de folato de leite materno) após a conclusão das análises estatísticas finais.

Análise estatística e de dados

Estatísticas descritivas serão usadas para os dados da linha de base dos participantes. Variáveis contínuas serão relatadas com uma média ± desvio padrão (ou mediana e intervalo interquartílico se não for normalmente distribuído) e variáveis categóricas como números absolutos por grupo e porcentagem. A contagem das cápsulas será usada para calcular a aderência dos participantes e o diário suplementar será usado para fornecer uma visão descritiva das barreiras de aderência. Os dados serão avaliados quanto à normalidade e as transformações ou uso de testes não paramétricos equivalentes serão considerados se os dados não seguirem uma distribuição normal. As análises estatísticas serão realizadas utilizando Stata (StataCorp, College Station, TX, EUA). Todas as análises serão inicialmente completadas com base na intenção de tratamento de acordo com a alocação inicial do grupo na linha de base e sem qualquer imputação por dados ausentes. As análises secundárias por protocolo serão conduzidas incluindo aqueles que completaram completamente o estudo e aderiram ao protocolo de estudo. A imputação múltipla será usada para corrigir os dados faltantes, conforme apropriado em análises de sensibilidade .

Análises primárias

Calcularemos a média ± desvio padrão dos resultados primários (folato sérico, folato de hemácias e UMFA plasmático) em cada grupo na linha de base e na linha de fundo, bem como a média ± desvio padrão da mudança dentro da mulher nesses resultados em cada grupo. Essas estimativas serão utilizadas para informar o cálculo do tamanho da amostra do estudo definitivo.

Análises secundárias

Análises explicativas dos desfechos primários serão conduzidas utilizando um modelo de regressão linear múltipla para investigar se a mudança da linha de base para a linha de base diferiu de acordo com o status do tratamento, ajustando-se para valores de linha de base e variáveis explicativas (EEDs, biomarcadores exploratórios, semanas de gestação no início do suplemento). Também será calculada a proporção de mulheres com UMFA ≥ 0,2 nmol/L (considerada uma concentração detectável) na linha de base e na linha de fundo em cada grupo. Para informar nosso objetivo secundário, a taxa de participação global no estudo será estimada dividindo o número total de mulheres inscritas pelo número total de mulheres que estavam interessadas em participar. A taxa de recrutamento semanal será estimada dividindo o número total de mulheres matriculadas pelo número total de semanas necessárias para recrutá-las. A taxa de retenção de participantes será estimada dividindo o número de mulheres que completam o ensaio completo pelo número total de mulheres inscritas. Para cada estratégia de recrutamento (incluindo cartazes, mídia social, boca a boca), alcance total (somente mídia social), perguntas, inscrições e custo serão avaliados. As probabilidades de inscrição depois de perguntar por cada estratégia serão avaliadas com um odds ratio. Conforme disponível, serão registrados os motivos de não inscrição.

Análises pós-parto

Calcularemos a média ± desvio padrão para proporção de ácido fólico no leite materno (dividindo a concentração de ácido fólico do leite materno pela soma de todas as formas de folato do leite materno) e para o folato materno pós-parto das hemácias. A regressão linear será usada para estimar a associação entre a concentração de ácido fólico do leite materno e o UMFA do plasma pós-parto materno. Os resultados pós-parto serão analisados posteriormente usando regressão linear múltipla, ajustando-se para valores de linha linha linha direta e variáveis explicativas (DFEs, semanas totais de suplemento, aderência ao protocolo de coleta de leite materno).

Segurança

Ácido fólico é fornecido em uma dose que atende às recomendações canadenses para mulheres grávidas (0,4-1,0 mg/dia); assim, é considerado de baixo risco. O sal de cálcio do ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico é reconhecido como seguro e está incluído nas multivitaminas pré-natais canadenses sem limite superior tolerável estabelecido (não se conhece atualmente nenhum risco de dano). A aleatorização ocorrerá entre 8 e 21 semanas de gestação (após o fechamento do tubo neural). Considerando o baixo risco deste estudo piloto, não foi considerada necessária a reunião de um comité de monitorização de dados. Todas as preocupações de segurança e, se necessário, a decisão de encerrar o estudo, serão abordadas pelos investigadores principais (CDK e JAH) e um investigador qualificado (CM) e reportadas ao Conselho de Ética em Pesquisa e à Health Canada. O desbloqueio dos códigos de intervenção pode ser realizado a qualquer momento, se for considerado necessário para o monitoramento da segurança dos participantes.