- Abstract
- 1. Introdução
- 2. Princípio do Microlens Immunoassay
- 3. Estrutura e funções de um instrumento de imunoensaio de microlentes
- 3.1. Sistema de irradiação de luz paralela
- 3.2. Sistema de imagem de alta resolução com foco automático
- 3.3. Sistema Automático Inteligente de Reconhecimento e Análise de Imagem
- 3,4. Sistema de controle de temperatura
- 3,5. Placa de teste de microlentes
- 4. Aplicação do Sistema de Imagem da Microsfera Imune
- 4.1. Medição da reação antígeno-anticorpo
- 4.2. Medição de Amostras Clínicas
- 5. Viabilidade da Imagem da Microsfera Imune para Detecção de Antigénio e Anticorpos
- 6. Conclusões
- Conflitos de Interesses
- Contribuições dos autores
- Agradecimentos
Abstract
Detecção e análise da reacção antigénio-anticorpo é uma das técnicas de detecção mais críticas nas áreas da medicina, biologia, ciências ambientais e segurança alimentar. Os métodos tradicionais e clássicos de detecção de antígenos e anticorpos encontram muitos problemas, tais como tempo, alto custo e baixa precisão. Uma nova técnica de imagem da microsfera imunológica pela microlente é usada para testar as alterações do índice de refração antes e depois da reação antígeno-anticorpo. Ela pode realizar rapidamente a determinação qualitativa e quantitativa da reação antígeno-anticorpo sem qualquer rotulagem, pré-modificação, pós-lavagem e enzimas caras. Aqui, apresentamos e discutimos o seu princípio e vantagens, estrutura de um instrumento de imunoensaio de microlentes, e potencial na medição de amostras clínicas. É promissor ser desenvolvido para aplicação no diagnóstico de doenças clínicas.
1. Introdução
Técnicas comuns disponíveis atualmente para detecção de antígenos e anticorpos incluem imunoensaio enzimático (ELISA), ressonância plasmonar superficial (SPR), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio coloidal de ouro (GICT), imunoensaio de imunofluorescência indireta (IFA), imunoensaio de quimioluminescência (CLIA), e imunoensaio turbidimétrico (PETIA). ELISA combina a amplificação da reação enzimática catalisada e a reação específica do antígeno e anticorpo com alta precisão e baixo custo, mas seus procedimentos são complicados com rigoroso controle de condições. O SPR foi desenvolvido nos anos 90 para detectar a interação entre biomoléculas e outras moléculas, e não requer nenhuma rotulagem e pode obter o resultado rapidamente, mas seu equipamento é caro e precisa de um grande volume de amostra. O RIA tem as características de alta sensibilidade, confiabilidade e baixa necessidade de volume de amostra. É amplamente utilizado na detecção de proteínas, enzimas e outras moléculas, mas o radionuclídeo é prejudicial à saúde e também altera as atividades biológicas das amostras, levando a erro experimental . Como um novo tipo de técnica de imunoensaio e um dos métodos mais comuns de detecção de antígenos e anticorpos, o GICT é fácil, simples e rápido com baixo custo, mas seu tamanho de amostra é limitado com baixa sensibilidade. CLIA, IFA, e PETIA também são amplamente utilizados na detecção de antígeno e anticorpos. Suas vantagens comuns são alta precisão, estabilidade, facilidade e rapidez, mas com alto custo e grande volume de amostra .
Uma técnica de imagem de microlentes imune para testar a mudança do índice de refração pode quebrar as limitações dos métodos acima. É rápido, sensível e simples, com não poluição e baixo custo para detectar e esperar ser amplamente aplicado em instituições médicas primárias. Esta técnica consiste na irradiação de luz paralela, câmera de alta resolução, software de análise inteligente, foco automático e sistemas de controle de temperatura com uma placa de teste de amostras de microlentes de múltiplos alvéolos e pode alcançar a detecção de antígenos e anticorpos em múltiplas passagens. O sistema de câmera de alta resolução pode atender aos requisitos de imagem de microlentes, e o uso de controlador de temperatura, autofoco e sistemas automáticos de análise inteligente pode reduzir muito os erros em experimentos para medições precisas.
2. Princípio do Microlens Immunoassay
Microlens é uma lente cilíndrica com uma extremidade de superfície esférica e a outra extremidade é uma superfície plana. Tem um forte efeito de amplificação e melhora significativamente a capacidade de imagem do microscópio óptico tradicional. Quando uma microlente com raio e índice de refração (RI) de é imersa em uma solução de () e iluminada por luz plana, devido ao efeito da refração, sua imagem é redonda com um anel escuro em sua borda . A relação entre o raio do ponto brilhante na imagem e outros parâmetros como , , , e a altura do cilindro da microlente é exibida da seguinte forma :onde está o ângulo incidente da luz até o topo esférico da microlente e . Com base nesta fórmula, as mudanças instantâneas do meio podem ser determinadas medindo o raio da mancha brilhante na imagem e o raio da microlente. Como a refração óptica ocorre à velocidade da luz, qualquer variação instantânea do RI no meio circundante de uma microlente pode induzir imediatamente uma mudança no raio do ponto luminoso central. Portanto, o método pode monitorar a mudança instantânea de RI/concentração com uma câmera de alta velocidade para a imagem (Figura 1).
(a)
(b)
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>(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
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3. Estrutura e funções de um instrumento de imunoensaio de microlentes
Como mostrado na Figura 2, fonte de luz paralela, imagens de alta resolução, análise inteligente automática, sistemas de autofocus e de controlo de temperatura, e uma placa de teste de microlentes de múltiplos alvéolos compõem um instrumento de imunoensaio de microesferas . Quando a fonte de luz paralela emite luz paralela para a microlente, o sistema de imagem de foco automático de alta resolução obtém uma imagem de foco automático em milissegundos. Em seguida, a imagem da microsfera imunológica é analisada pelo sistema de software de análise inteligente para deduzir valores de e também a concentração de antígeno/anticorpo. A função do sistema de controle de temperatura é ajustar diferentes temperaturas exigidas para diferentes reações antígeno-anticorpo. Todo o processo gasta não mais que 2 minutos.
3.1. Sistema de irradiação de luz paralela
LED como fonte de luz paralela produz uma área de iluminação paralela cilíndrica, que é semelhante a um condensador original com vantagens de baixo custo, longo ciclo de vida útil, perfeito desempenho luminoso e pequena escala . Como mostrado na Figura 3, a luz paralela real pode ser recebida devido à refracção da lente . Na área de irradiação do LED, a lente pode mudar a direção e distribuição da luz configurando a lente relevante para que a luz paralela real seja obtida (Figura 3).
3.2. Sistema de imagem de alta resolução com foco automático
Este sistema consiste em uma câmera digital de alta velocidade e um sistema de foco automático. Atualmente, a velocidade de imagem de algumas câmeras digitais comerciais ultrapassou 10.000 quadros por segundo . Portanto, o sistema de imagem de alta resolução pode alcançar o monitoramento em tempo real das mudanças dinâmicas do RI na solução. Uma câmera CCD de alto pixel desempenha um papel importante na obtenção de uma imagem de microlentes de alta resolução . Os núcleos do sistema de foco automático consistem na identificação da imagem, processamento da imagem e peças de controle . As imagens coletadas pelo sistema de câmera são analisadas, e a avaliação de nitidez é mostrada. De acordo com esta avaliação, o sistema é automaticamente conduzido para uma área ou direção apropriada até que a resolução das imagens adquiridas satisfaça os requisitos pré-definidos.
3.3. Sistema Automático Inteligente de Reconhecimento e Análise de Imagem
O sistema automático de análise inteligente conduz principalmente o reconhecimento de imagem e análise de dados na imagem da microlente, de modo a monitorar a variação instantânea da sua imagem e assim deduzir a mudança do índice de refração da solução da amostra durante o processo de reação antígeno-anticorpo. Sua precisão está intimamente relacionada à qualidade da imagem, e parâmetros como pixel, tamanho de pixel e resolução afetam diretamente a medição do RI . Se a câmera digital CCD com ≥10 milhões de pixels e tamanho de pixel pequeno que atinge menos de 3 nm e uma microlente com raio de 600 μm for explorada, a alteração do índice de refração é determinada por alterações da razão do ponto brilhante central e da razão do raio do anel externo de modo que a alteração medida do índice de refração possa atingir 10-6 .
3,4. Sistema de controle de temperatura
O sistema de controle de temperatura é uma placa de vidro transparente temperado com uma fina película de óxido de estanho índio e controlado por um controlador de temperatura PID (proporcional-integral-derivativo) de alta precisão. Ele permite que a temperatura da amostra na placa de teste de microlentes multipoços atinja rapidamente um valor ajustado em 2 min e seja mantido dentro da faixa de variação de 0,1°C para tornar a reação antígeno-anticorpo efetiva .
3,5. Placa de teste de microlentes
A placa de microlentes de multipoços foi especialmente concebida para um instrumento de imunoensaio de microlentes. É feita de material polimetilmetacrilato (PMMA) e é geralmente preparada como 2 ou 16 poços trapezoidais para satisfazer diferentes requisitos de detecção. Dentro de cada poço há uma microlente com um raio de várias centenas de microns no seu fundo. A aplicação da placa de microlentes proporciona uma condição objetiva para a detecção multicanal. Como o diâmetro da parte inferior do poço é de apenas cerca de 2 mm, vários microlitros de solução de amostra são suficientes para afogar as microlentes para a detecção de antígenos-anticorpos.
4. Aplicação do Sistema de Imagem da Microsfera Imune
4.1. Medição da reação antígeno-anticorpo
Huang e seus colegas detectaram vários tipos de reações antígeno-anticorpo e descobriram suas características regulares. Primeiro, o índice de refracção mudou com o tempo de reacção no processo de reacção antigénio (Ag)-anticorpo (Ab). Segundo, houve três fases na variação do RI com o tempo de reação, incluindo períodos de rápido aumento, relativamente estáveis e lentamente decrescentes. A primeira fase foi relacionada à combinação de Ag e Ab, de modo que o RI foi aumentado subitamente com a combinação rápida de Ag e Ab para formar complexos. O máximo do RI está na segunda fase. Terceiro, a concentração do Ag ou Ab teve uma grande influência sobre o RI. Assim, ao obter a mudança de RI em função da concentração do Ag ou Ab, seu conteúdo em amostras testadas pode ser calculado pela curva de ajuste. Quarto, diferentes anticorpos, como o Ab de captura e Ab de sondagem, também influenciariam a variação do RI. Usando esta técnica para medir as reações antígeno-anticorpo por vários sistemas Ag-Ab, as relações entre a mudança do índice de refração e as concentrações de vários tipos de soluções antígeno-anticorpo (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, Ag-Ab, calicreína 6 (KLK6) Ag-Ab, gonadotropina coriónica humana (HCG) Ag-Ab, troponina cardíaca (cTnI) Ag-Ab, proteínas de ligação de ácidos gordos (FABP) Ag-Ab, e proteína C-reativa (CRP) Soluções de Ag-Ab) podem ser obtidas (Figura 4). Como sabemos que a associação e dissociação do complexo antígeno-anticorpo é um processo dinâmico, baseado na curva de RI vs. tempo e cálculo da derivada de com o tempo, pode-se também obter informações sobre as constantes de associação e taxa de dissociação e (Figura 4(a)) e outros parâmetros termodinâmicos, usando a seguinte equação:
(a)
(b)
(c)
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(b)
(c)
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4.2. Medição de Amostras Clínicas
A técnica de imagem da microsfera imunológica foi ainda utilizada para testar amostras clínicas. 36 amostras clínicas foram detectadas por esta para concentrações de CRP Ag. Seu desvio padrão relativo é de cerca de 2-10% em comparação com a imunocromatografia, e o coeficiente de correlação entre os resultados adquiridos pelas duas vias chega a 0,989 (Figura 5). É bem sabido que amostras de soro hemolisado clinicamente podem ter um grande impacto na precisão dos resultados detectados através dos métodos tradicionais. Pelo contrário, as imagens das microlentes nas amostras hemolizadas ainda são claras através desta técnica. Os erros relativos entre os valores de antígenos detectados nas amostras com hemólise e nas amostras sem hemólise são de apenas cerca de 2%, indicando a menor influência das amostras de soro hemolisado sobre a precisão dos resultados.
5. Viabilidade da Imagem da Microsfera Imune para Detecção de Antigénio e Anticorpos
A maior parte dos antigénios são proteínas enquanto alguns são polissacarídeos, ácidos nucleicos e outras substâncias, e todos os anticorpos são proteínas. Como a proteína contém uma grande quantidade de amido e carboxilo, estes grupos polares fazem com que as partículas coloidais produzam uma carga elétrica devido à ação eletrostática, e as partículas com a mesma carga foram repelidas umas às outras. Ao mesmo tempo, os grupos polares que são fortemente hidrofílicos reagem com moléculas de água e formam uma camada de hidratação para produzir um colóide hidrofílico, garantindo que a proteína não se aglomere para formar um precipitado, de modo que as partículas coloidais são uniformemente dispersas em uma solução .
Quando o antígeno é combinado com anticorpos, a carga elétrica das partículas coloidais reduz ou desaparece, e a camada de hidratação também desaparece ou se torna fina. A proteína muda de colóide hidrofílico para colóide hidrofóbico. No ambiente do eletrólito, as partículas coloidais se aglomeram ainda mais para formar os complexos antígeno-anticorpo que podem ser realizados pelos olhos . Os índices de refração do colóide hidrofílico e hidrofóbico são notavelmente diferentes. Portanto, esta técnica pode monitorar mudanças dinâmicas do índice de refração para julgar se ocorrem reações antigênicas e de anticorpos em uma solução. Uma curva padrão pode ser estabelecida de acordo com uma relação entre a concentração de antígeno e anticorpos e seu tempo de reação. O complexo torna-se maior com o processo de reação antígeno-anticorpo, e a mudança do índice de refração também se torna mais óbvia. Usando a curva padrão, é fácil quantificar a concentração de anticorpos ou antígenos detectados.
Foi demonstrado que um anticorpo que é complementar a epitopos de antígenos diferentes de fato induziria um incremento de RI similar na reação Ag-Ab com o imunoensaio por imagem de microlentes. Como mostrado nas Figuras 4(b) e 4(c), as medidas de antígenos foram realizadas usando a captura Ab e sondagem Ab ou monoclonal Ab e policlonal Ab para um determinado antígeno. A partir das curvas, podemos ver que não houve diferença significativa entre os dois tipos de anticorpos na indução de mudança durante a reação Ag-Ab, indicando que o imunoensaio por imagem de microlentes pode usar diferentes tipos de anticorpos, seja o Ab de captura ou de sondagem e o Ab monoclonal ou policlonal para detecção. No entanto, o monoclonal Ab é preferido para o imunoensaio por imagem de microlentes, pois não só induz maior reação por sua maior afinidade com o antígeno, mas também reduz a possibilidade de reação cruzada falso positivo, de modo que os antígenos podem ser detectados em concentrações mais baixas. Em geral, a reação cruzada é teoricamente inevitável para esta técnica como outros meios envolvidos no imunoensaio. Em outras palavras, a especificidade da imagem dos microlentes imunológicos depende completamente da dos anticorpos selecionados contra o antígeno alvo. Portanto, é muito importante selecionar anticorpos apropriados e otimizar o sistema de reação Ag-Ab.
6. Conclusões
Esta técnica de imagem de microlentes imunológica pode medir rápida e precisamente o RI de diferentes amostras e monitorar as mudanças do RI em tempo real no processo de reação de antígenos e anticorpos. O RI se altera com mudanças na concentração do Ag ou Ab. Assim, de acordo com a alteração do RI em função da concentração do Ag ou Ab, o conteúdo das amostras pode ser calculado qualitativa e quantitativamente sem qualquer rotulagem, pré-modificação, pós-lavagem e enzimas caras. Em comparação com as formas convencionais de detecção, as vantagens deste método são precisas, confiáveis, rápidas (terminadas em vários minutos) e simples, sem poluição. Além disso, seu limite de detecção é tão baixo quanto pg/ml, o que requer apenas vários μl suficientes para realizar a detecção e também é adequado para amostras clínicas hemolizadas que são difíceis de serem detectadas com métodos tradicionais. Além disso, é não intrusivo para as amostras. O sistema paralelo de irradiação luminosa, o sistema de câmera de alta resolução, o sistema automático de análise inteligente, o sistema de autofoco, o sistema de controle de temperatura e a placa de detecção porosa de microlentes compõem o instrumento de imunoensaio da microsfera. É pequeno e fácil de transportar.
É bem conhecido que a reação antígeno-anticorpo é muito influenciada por sua própria concentração, temperatura, pH, e solução eletrolítica. Por esta razão, estes fatores são levados em consideração no sistema de imagem de microlentes para manter os dados estáveis através do equilíbrio de suas alterações. Por exemplo, este sistema pode ser otimizado selecionando materiais adequados para uma placa de teste que oferece um local de reação antígeno-anticorpo e tornando a placa hidrofílica para evitar interferência hidrofóbica. A precisão da detecção pode ainda ser melhorada ajustando a proporção antígeno-anticorpo, rastreando o diluente adequado, modificando-os com íons metálicos, e assim por diante.
Detecção de antígeno e anticorpo é relativamente significativa nos campos da investigação biomédica, diagnóstico clínico, análise de medicamentos, segurança alimentar, e monitorização ambiental. Com as preocupações das pessoas com a saúde ambiental, segurança alimentar e saúde, desenvolver um instrumento sensível com baixo custo, alta precisão, tamanho pequeno, portabilidade e operação simples tornou-se uma necessidade social premente. Assim, esta técnica de imagem de microlentes imunes promete ser amplamente aplicada em vários campos e apropriada para ser especialmente popularizada na comunidade e no campo.
Conflitos de Interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Contribuições dos autores
Jiahui Liang e Xiaotian Ye contribuíram igualmente para este trabalho.
Agradecimentos
Estamos gratos ao Programa de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou Projecto Principal de Inovação Sinergética (número de subvenção: 201604020146) e à Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (números de subvenção: 81172824 e 30971465) pelo seu apoio financeiro.