A Biology of p38 Kinase
O caminho de sinalização p38 MAPK tem sido um dos tópicos mais intensamente estudados em biologia desde a sua identificação inicial há mais de 10 anos. O nível de interesse nesta via tem sido impulsionado principalmente por dois fatores. Primeiro, esta via de sinalização é ativada por uma ampla gama de estímulos, e está implicada em numerosas doenças, mais notadamente inflamações. Em segundo lugar, a disponibilidade precoce de inibidores seletivos do p38 forneceu as ferramentas críticas necessárias para delinear ainda mais o papel que as proteínas kinases desempenham nas vias de sinalização, e os meios para perseguir o potencial terapêutico da inibição do p38. De fato, durante os últimos 5 anos, um grande número de inibidores do p38 entrou em ensaios clínicos.
Na época da descoberta do p38 MAP kinase, o primeiro membro da família MAP kinase, a kinase extracelular de sinal regulado (ERK), já tinha sido identificada. Não foi apreciado, no entanto, que existissem duas subfamílias adicionais de dupla especificidade de três linhas de cinase/tirosina (p38 e JNK). Em 1994, vários grupos de pesquisa identificaram independentemente uma nova atividade de cinase (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;) e, posteriormente, a clonagem do cDNA humano levou à identificação da p38 α (Lee et al., 1994). Pouco tempo depois, três outras variantes de emendas da família p38, p38β, P38y, e p38h foram identificadas (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). Dois membros da família, p38α e β, são ubíquamente expressos mas regulados de forma diferente em diferentes tipos de células, enquanto os outros dois são mais restritos na distribuição dos tecidos. Até hoje, p38α, que tem sido implicado em uma série de doenças, é o membro mais bem compreendido da família (revisado em Kumar et al., 2003 e Saklatvala, 2004).
Ativação da p38 tem sido observada em vários organismos como uma resposta a muitos estímulos. Os ortologues p38α em leveduras, vermes e sapos têm sido implicados na osmoregulação, respostas ao estresse e regulação do ciclo celular. A regulação do p38α em células de mamíferos também tem sido bem estudada (revista em Zarubin e Han, 2005). Está agora claro que o caminho de sinalização do p38α é complexo, influenciado não só por estímulos e tipo celular, mas também por vários reguladores e combinações de kinases ativadoras a montante. É bem conhecido que existem duas principais kinases ativadoras a montante para p38α, MKK3 e MKK6. Além disso, existe um mecanismo independente da MKK de ativação do p38α que envolve a transformação do fator de crescimento ativado da proteína quinase 1 (TAK1)-binding protein kinase (TAB) (Ge et al., 2002). A ativação do p38α pode ser realizada por autofosforilação após interação com a TAB1. Sugere-se também que a p38 regula negativamente a sinalização da TAK1 através da fosforilação da TAB1 (Cheung et al., 2003). A jusante da sinalização do TAK1 está o IKK, que serve como uma etapa essencial da ativação da quinase Tpl2 e seus alvos a jusante, MEK1 e ERK (Waterfield et al., 2004). Assim, a inibição da p38 resulta na upregulação do TAK1, o que leva à ativação do ERK. Isto explica porque a ativação da ERK é frequentemente observada em células tratadas com inibidores p38α. Este achado destaca a necessidade de entender potenciais crosstalk não lineares entre as vias de sinalização cinase. Além do TAK1, outras kinases a montante (MAP3K) também estão implicadas na ativação do p38α e do seu vizinho próximo, JNK. Também contribuem para o processo de ativação pequenas proteínas de ligação GTP como Rac1 e Cdc42 e sua interação com PAK (p21-activated kinases) e MLK1.
Downstream substratos de p38 MAP kinases são MAPKAPK2 (Kotlyarov et al.., 2002) e MAPKAPK3 (McLaughlin et al., 1996), que fosforilam vários substratos – incluindo pequena proteína de choque térmico 27 (HSP27), proteína linfocitária específica 1(LSP1), proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP (CREB), fator de transcrição (ATF1), SRF, e tirosina hidroxilase. De especial interesse é a tritetraprolina de substrato MAPKAPK2, uma proteína que desestabiliza o mRNA (Tchen et al., 2004). O MNK é outro substrato p38 que parece estar envolvido na iniciação translacional, pois ele fosforila eIF-4E (Waskewicz et al., 1997). Além disso, a quinase ativada p38 (PRAK) e a mitógena e proteína quinase ativada por estresse (MSK1) também são conhecidas por serem ativadas por p38α, embora a MSK1 também seja ativada por ERK (Deak et al., 1998). Não surpreendentemente, há um grande número de fatores de transcrição que são regulados pela p38 (revisado em Zarubin e Han, 2005). Alguns exemplos incluem a ativação dos fatores de transcrição 1, 2, e 6, proteína acessória SRF (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, fator de melhoramento de miócitos 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT, e proteína da caixa de grupo de alta mobilidade (HBP1). Outras proteínas não relacionadas, como cPLA1, Na+/H+ isoforma-1 (NHE-1), tau, queratina 8, e estathmina também demonstraram ser substratos para p38α.
O mecanismo pelo qual os inibidores p38 MAP kinase suprimem a expressão de citocinas inflamatórias tem sido elusivo. A expressão do gene inflamatório é altamente regulada tanto a nível transcripcional quanto pós-transcricional. Estudos iniciais examinando os efeitos dos inibidores do p38 em monócitos humanos sugeriram que a regulação da biossíntese inflamatória das citocinas (principalmente IL-1 e TNF) ocorreu no nível pós-transcrítico. Posteriormente, tornou-se evidente que a estabilidade do mRNA pode ser influenciada negativamente pela inibição da via do p38 (Frevel et al., 2003). Esta observação levou estudos adicionais a mostrar que outras proteínas de resposta inflamatória, como a COX-2, foram afetadas de forma semelhante (Lasa et al., 2000). Outros mRNAs que são estabilizados pelo p38 incluem MIP-1a, gm-CSF, VEGF e MMP-1 e -3 (Dean et al., 2004). Curiosamente, MAPKAPK-2, um substrato para p38, também está envolvido na estabilização do mRNA por p38. As formas catalíticamente ativas do MAPKAPK-2 estabilizam o mRNA repórter, enquanto o MAPKAPK-2 negativo dominante bloqueia sua expressão (Winzen et al., 1999).
Uma característica comum das características estruturais que influenciam a estabilidade do mRNA é o motivo rico em AU na extensão 3′UTR. Este motivo foi primeiramente descrito por Shaw e Kamen (1986). Existem três classes distintas desses elementos ricos em AU (AREs): uma contém um pequeno número de AREs (como c-Fos), a segunda contém um número maior de AREs possuindo vários pentímetros (como TNFα, COX-2, etc.), e a terceira classe contém AREs sem os pentímetros, mas contendo regiões ricas em U. As AREs têm como alvo o mRNA para uma rápida mortinilação nas células. Em geral, as AREs reguladas pela p38 têm motivos estruturais similares com pentímetros múltiplos e sobrepostos no 3′UTRs. Há exceções, entretanto, como MMP-1 e -3 (Reunanen et al., 2002) e tristetraprolin (Mahtani et al., 2001, Tchen et al., 2004), mRNAs que contêm pelo menos uma sequencia pentamericana, e U-richos. O mecanismo preciso pelo qual a p38 regula a estabilidade dos mRNA permanece pouco claro. Pensa-se que a kinase a jusante MAPKAPK-2 está envolvida, bem como uma proteína elusiva de ARE-glutinante. Existem vários candidatos (Dean et al., 2004), mas nenhum preenche todos os critérios para ser a proteína que liga os caminhos do p38 e o mRNA contendo ARE. Destes, a tristetraprolina é uma possibilidade interessante, embora sirva principalmente como um “off-switch” na estabilização do mRNA.
Um grande conjunto de dados de estudos pré-clínicos indica um papel central da p38 nas respostas imunológicas e inflamatórias (Dong et al., 2002; Kracht e Saklatvala, 2002; Kumar et al., 2003). Sabe-se agora que o caminho do p38 é ativado seletivamente nas células T do efeito Th1 em resposta à IL-12 e IL-18. A produção de citocinas Th1, como interferon gama, é inibida pelos inibidores p38, enquanto a produção de IL-4, uma citocina Th2, não o é. Em macrófagos, várias citocinas inflamatórias – como TNF, IL-1, IL-6 e IL-8 – são reguladas através das vias da p38. O fibroblasto embrionário do MKK3 responde à TNF, mas não à IL-1, UV ou sorbitol, indicando assim um papel do MKK3 na TNF, mas não na ação da IL-1. No p38α knock-out de fibroblastos embrionários de camundongo, entretanto, a produção de IL-1 induzida pela IL-6 está severamente comprometida. Estes dados sugerem que diferentes ligandos irão eliciar a função de diferentes kinases na via p38. Juntamente com um grande corpo de evidências farmacológicas genéticas e in vivo, estes resultados apoiam o p38 como um alvo válido, cuja inibição poderia proporcionar benefício terapêutico em uma variedade de doenças inflamatórias, particularmente artrite reumatóide (Foster et al., 2000). Outras possibilidades de intervenção farmacológica incluem hipertrofia cardíaca, doença de Alzheimer, lesão vascular, psoríase e doença inflamatória intestinal.