Validação de T1R2/T1R3 como o principal receptor de sabor doce de mamífero foi obtido a partir de estudos usando ratos knockout para os genes T1R1, T1R2, ou T1R3, bem como um rato knockout duplo para os genes T1R2 e T1R3. Esses camundongos foram testados usando breves ensaios comportamentais de acesso e registros eletrofisiológicos de cordas timpânicas e nervos glossofaríngeos.55,56 Camundongos T1R2-nulos apresentaram perda de preferência e respostas neurais para edulcorantes artificiais e grande diminuição das respostas para açúcares naturais. Os camundongos T1R3-nulos perderam respostas comportamentais e eletrofisiológicas tanto para os estímulos umami quanto para os adoçantes artificiais e tiveram respostas muito diminuídas para os açúcares. Somente o animal com dupla nocaute perdeu completamente as respostas residuais aos açúcares naturais, sugerindo que T1R2 ou T1R3 pode operar como um monômero ou um homodímero. De fato, células HEK-293 expressando apenas o rato T1R3 responderam ao açúcar elevado;50 curiosamente, estas respostas não foram observadas com o T1R3 humano. Estes estudos knockout demonstraram inequivocamente o papel essencial das proteínas T1R T1R2 e T1R3 na detecção e percepção do doce. Da mesma forma, em um knockout natural fascinante, a família Felidae adquiriu uma mutação de perda de função no gene T1R2 no início da evolução e consequentemente perdeu o gosto doce, explicando a indiferença dos gatos pelo açúcar.57

Como poderiam tão poucos receptores doces explicar o grande número de espécies e diferenças individuais na percepção do gosto doce? Essas diferenças podem ser explicadas por diferenças nas sequências genéticas entre espécies e por polimorfismos dentro de uma espécie. Em expressão heteróloga, apenas o T1R2/T1R3 humano respondeu ao aspartame e ciclamato, enquanto os receptores do rato, que é indiferente a estes compostos, não o fizeram.51 Mais notavelmente, o rato T1R2-nulo expressando o transgene T1R2 humano mostrou respostas a várias moléculas reconhecidas como doces pelos humanos, às quais os ratos são indiferentes.55 Dentro de uma espécie, múltiplos polimorfismos de várias linhagens de camundongos claramente afirmam o status de provador e não provador desses animais.54,58 Esses polimorfismos não agem bloqueando a expressão gênica ou a tradução de proteínas, mas são considerados como interferindo na capacidade de formar dímeros ou ligar adoçantes. Em humanos, os polimorfismos associados ao promotor T1R3 ajudam a explicar as conhecidas diferenças na sensibilidade gustativa à sacarose.59

Outro paradoxo emergente da descoberta de receptores doces é como tão poucos receptores podem reconhecer uma gama tão diversa de estímulos como carboidratos, aminoácidos, proteínas e edulcorantes artificiais. Estudos de estrutura-função desses receptores identificaram múltiplos domínios de ligação dentro do complexo dimer, o que explica como essa grande diversidade pode ser atendida.60,61 Por exemplo, o domínio flytrap Vênus de T1R2 é necessário para a ligação do aspartame e neotame, o domínio transmembrana de T1R3 é necessário para o ciclamato,62,63 e a região rica em cisteína de T1R3 é necessária para responder à brazzeína da proteína doce.64 A lactisole, um antagonista doce, liga-se a uma bolsa dentro do domínio transmembrana do T1R3 humano;65 curiosamente, a mudança de dois aminoácidos no domínio transmembrana 5 do receptor do rato explica sua insensibilidade a este antagonista.66 Até o momento, todos os quatro domínios do dímero T1R2/T1R3 – os dois domínios N-terminais e os dois domínios transmembrana – foram implicados na ligação dos ligandos, cada um com afinidades distintas com seus ligandos correspondentes.

Muitas das mesmas estratégias experimentais que confirmaram T1R2/T1R3 como o receptor doce confirmaram T1R1/T1R3 da mesma forma que o receptor umami. Quando expresso heterologicamente, o dímero humano T1R1/T1R3 responde seletivamente ao l-glutamato,51 enquanto o dímero do mouse é mais promíscuo entre seus ligandos, respondendo a praticamente todos os enantiômeros l- (mas não d-) dos 20 aminoácidos padrão.48,67 Estudos Knockout documentam ainda o dímero T1R1/T1R3 como o receptor umami. Os estudos Knockout de T1R1 ou T1R3 eliminaram respostas comportamentais e eletrofisiológicas ao glutamato.55 Além disso, uma característica do gosto umami é sua potencialização por ribonucleotídeos como o inosina 5′-monofosfato (IMP) e guanosina-5′-monofosfato (GMP). Esta potenciação é observada de forma semelhante na expressão heteróloga e ausente nos ratos T1R1 ou T1R3 knockout. Em contraste com o receptor de sabor doce, os domínios funcionais do receptor umami são menos explorados. Usando receptores quiméricos, mutagênese dirigida ao local e modelagem molecular, um modelo cooperativo de ligação ligante foi proposto onde o glutamato se liga ao domínio flytrap de Vênus T1R1 (próximo à região da dobradiça) e o IMP se liga a um local adjacente estabilizando a mudança conformacional.68

Ainda há debate se o dímero T1R1/T1R3 é o único receptor funcional de glutamato nos TRCs.50,69 Antes da descoberta da família T1R, uma forma truncada única do receptor mGluR4 expressa em TRCs foi relatada como o receptor umami.70 No entanto, foi apontado que este receptor está faltando uma grande parte do domínio flytrap Vênus, que é essencial para a ligação do glutamato, e carece de sinergia para glutamato e ribonucleotídeos.50 Estas características fazem com que seja menos provável que seja um receptor candidato para umami. No entanto, a dificuldade de dissociar as respostas de sódio e glutamato do MSG, as respostas umami residuais em alguns ratos nocturnos T1R3,56 e a redução das respostas de glutamato aos antagonistas do mGluR71 deixam em aberto a questão dos múltiplos receptores umami.