Abstract

Este artigo relata um caso de miasiasis causada por Hypoderma sinense num homem europeu de regresso de uma viagem pelo norte da Índia. O paciente mostrou eosinofilia, sinais sistêmicos de inflamação e inchaços dolorosos em várias partes do corpo. O diagnóstico foi confirmado por sorologia específica e identificação molecular de parasitas.

O gênero Hypoderma (Diptera: Oestridae) inclui sete espécies de moscas que, na fase larval, podem causar miíase interna. Em ruminantes domésticos e selvagens, a doença é caracterizada pela presença de deformações subcutâneas nas regiões dorsal e lombar. 1 Casos humanos de hipodermose têm sido associados com miíase subcutânea, 2 oftalmomíase, 3 e meningite, 4 embora os sintomas mais comuns sejam alergias cutâneas acompanhadas de eosinofilia. 5,6 Na China, a hipodermose é uma das mais importantes infecções por artrópodes em bovinos e iaques, especialmente nas regiões norte do país 7, onde sua prevalência pode chegar a 90% a 100%. Em alguns casos, pode haver 400 larvas afetando um único animal. 8 As maiores prevalências conhecidas de hipodermose humana (0,4%-7%, nos agricultores) têm sido relatadas nas mesmas áreas. 9 Em vários países europeus, tratamentos com formulações injetáveis ou pour-on ivermectin têm sido usados para o controle nacional da hipodermose bovina (revisado por Boulard et al. 10 ), resultando na redução da prevalência da infecção para apenas 0,5%. De fato, no Reino Unido, Irlanda e Dinamarca a hipodermose de gado foi erradicada. Consequentemente, o número de relatos de infestação humana por Hypoderma spp. tem sido grandemente reduzido. No entanto, o movimento crescente de pessoas ao redor do mundo, em particular, de e para países em desenvolvimento, pode expor os viajantes a esses patógenos “exóticos” agora.

Este artigo relata um caso de hipodermose humana importada em um homem europeu retornando do norte da Índia. O paciente mostrou sintomas graves que clinicamente se assemelhavam aos de outras parasitoses, levando a diagnósticos iniciais errados de filariose linfática, gnathostomiasis, e esparganose. A extração cirúrgica das larvas sugeriu o diagnóstico de uma provável miíase, embora só após a realização de um teste de imunoabsorção enzimática anti-Hypoderma (ELISA) é que o diagnóstico foi confirmado. O agente causal foi identificado como Hypoderma sinense por métodos moleculares.

Case Report

O paciente era um homem espanhol de 34 anos que tinha viajado para Ladakh, uma área montanhosa no norte da Índia, como guia turístico em agosto de 2006. Caprinos e iaques são criados na área. Em Outubro de 2006, o paciente começou a notar desconforto e dor abdominal. Um mês depois ele começou a sofrer de inflamação dolorosa na virilha direita e na região testicular. O paciente foi inicialmente tratado num hospital em Madrid, onde foi submetido a ultra-sons, tomografia computorizada (TAC) e exames de ressonância magnética (RM). Estes revelaram inflamação da medula espermática direita e adenopatia ilíaca e inguinal. O paciente também apresentou notável eosinofilia (5.100 eosinófilos/µL, 31,2%). Os testes dia e noite do nível de microfilariose no sangue apresentaram resultados negativos, como realizado pela reação em cadeia da polimerase específica da filariose (PCR), testes para parasitas fecais e urinários, e parasitas (filariose, triquinose, toxocariose, anisakiase, estrongiloidose), bacterianos (brucelose, salmonelose, tuberculina, micobactérias urinárias), e testes serológicos virais. Apesar dos resultados laboratoriais, suspeitou-se de filariose linfática e o paciente foi tratado com albendazol (dose única de 400 mg) e dietilcarbamazina (6 mg/kg/d/15 d) mais prednisona (60 mg/d/5 d). Após o início do tratamento com prednisona, a contagem de eosinófilos diminuiu significativamente para 100/µL (0,4%), aumentando novamente para 2.590/µL (21,1%) uma vez que o tratamento foi suspenso.

Em Janeiro de 2007, o paciente foi encaminhado para o Hospital Carlos III, Madrid, por esta altura com a coxa esquerda inchada. Na anamnese, referiu-se a ter notado inchaços cutâneos um pouco dolorosos, transitórios (com duração de 2-7 d), eritematosos, em diferentes locais durante a sua viagem de verão. Ao exame, foram detectados inchaços no cordão espermático direito, no terço superior da coxa esquerda e no flanco esquerdo (Figura 1). O paciente nunca sofreu de febre. No momento da consulta, o tratamento com prednisona tinha sido suspenso durante 2 semanas, e a contagem de eosinófilos tinha atingido 7.000/µL (41%). Foram realizados testes directos (ou seja, níveis de microfilariose sanguínea e parasitas fecais), serológicos (ou seja, anisakiase, filariose, esquistossomose, tricinelose, toxocariose, fasciolose, equinococose e gnathostomiasis), e parasitológicos. Para o último destes testes, a amostra foi enviada para o Centro Internacional de Referência em Gnathostomiasis, na Tailândia. Como havia suspeita de gnathostomiasis, o paciente foi hospitalizado e tratado com albendazol (400 mg/12 h/3 wk). Para evitar mascarar a eosinofilia, não foram administrados corticóides. O paciente foi informado de que o tratamento com desparasitação poderia mobilizar parasitas em direção à superfície corporal, permitindo sua remoção e identificação cirúrgica, permitindo assim a determinação de um curso de tratamento adequado. Cinco dias após o tratamento, os inchaços cutâneos do paciente tornaram-se extremamente dolorosos e surgiram duas lesões nodulares, uma na região glútea e outra no dorso. O ultra-som revelou um parasita parecido com um verme dentro de cada inchaço. Estes dois parasitas esbranquiçados, de forma oval (10 × 3 mm e 6 × 2 mm, respectivamente) foram removidos cirurgicamente. A análise morfológica de um fragmento de um dos parasitas sugeriu que poderia ser uma larva de mosca (Figura 1). O outro espécime foi submetido a exame histológico, mas este não forneceu resultados úteis. Cinco dias após o início do tratamento com albendazol, a contagem de eosinófilos atingiu 29.800/µL (78%), coincidindo com o início de dores extremas devido aos inchaços cutâneos. No final do tratamento com albendazol, a contagem de eosinófilos diminuiu para 18.897/µL (67%). O tratamento com Ivermectina (12 mg/d/2 d) foi portanto administrado, a partir de 8 de Fevereiro de 2007. A contagem de eosinófilos diminuiu para 2.900/µL (30%), e o paciente permaneceu assintomático por alguns dias, após o que outro inchaço doloroso apareceu na perna direita e a contagem de eosinófilos subiu para 3.100/µL (34%). O tratamento com ivermectina foi repetido em 3 de março de 2007, e alguns dias depois a contagem de eosinófilos tinha diminuído para 1.600/µL (20,6%). Entretanto, a sorologia negativa para o Gnathostoma foi confirmada. Cinco dias após o segundo tratamento com ivermectina, reapareceram inchaços cutâneos altamente dolorosos em várias partes do corpo que impediram o paciente de realizar a sua rotina normal. Foi, portanto, decidido administrar um tratamento empírico para uma potencial esparganose, baseado em casos clínicos semelhantes descritos na literatura. 12 O tratamento com praziquantel começou em 22 de março de 2007 com uma dose de 75 mg/kg/dia/3 dias, mas não foram observadas alterações clínicas significativas nem a contagem de eosinófilos foi reduzida. Vários dias após o início deste tratamento, foi recebido um resultado sorológico negativo para esparganose. Como o paciente continuou a sofrer de inchaços cutâneos dolorosos graves e hipereosinofilia, foi administrada uma terceira rodada de ivermectina (12 mg/dia/3 d). Após este último tratamento, o paciente rapidamente se tornou assintomático. Nenhum inchaço cutâneo reapareceu e a contagem de eosinófilos normalizou rapidamente. O paciente permaneceu assintomático até hoje, 2 anos depois.

Detecção de Anti-Hypoderma spp. Igg Antibodies

Desde que nem os testes serológicos múltiplos nem os testes microscópicos realizados foram conclusivos, e porque a análise morfológica do fragmento larval sugeriu miíase (Figura 2), foram realizados testes imunodiagnósticos para hipodermose utilizando soros retrospectivos e rastreadores do paciente. Três amostras de soro consecutivas foram enviadas para o Laboratório da Escola Veterinária de Lugo. Os anticorpos anti-Hypoderma foram procurados por ELISA indireto usando um extrato bruto obtido dos primeiros instantes de Hypoderma lineatum, como descrito por Panadero et al. 13 Diferentes diluições do antígeno, soros e imunoconjugado foram testados seguindo um protocolo previamente descrito. 14 A especificidade do procedimento foi avaliada através do teste de três soros humanos positivos para o Gnathostoma. Títulos elevados de anticorpos anti-Hypoderma foram detectados durante o curso da doença (DO 4,359 em 24 de Novembro de 2006), aos 3 meses pós-infecção (p.i.) (em 24 de Novembro de 2006), e após o tratamento (DO 3,977 aos 7 meses p.i. e 4,044 aos 15 meses p.i.). Estes níveis elevados de anticorpos contra antigénios H lineatum confirmaram o diagnóstico de uma infestação por larvas estranhas.

Parasite Molecular Identification

Genomic DNA foi extraído dos tecidos do parasita larval usando o Quantum Prep AquaPure Genomic DNA Kit (BioRad, Hercules, CA, EUA). A sequência hipervariável do gene citocromo oxidase I (cox1) que codifica a região do laço externo 4 (E4) até ao carboxi-terminal (COOH) da proteína (688 bp) foi amplificada por PCR, como descrito anteriormente. 15 Os produtos PCR foram detectados em gel de 1,6% agarose-Tris-acetate-EDTA (TAE), purificado usando colunas Ultrafree-DA (Amicon, Billerica, MA, EUA), e então diretamente sequenciado em um seqüenciador ABI-PRISM 377 usando o Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os fragmentos mitocondriais foram sequenciados em ambas as direções. As seqüências foram alinhadas usando o programa ClustalX e examinadas a olho nu. A comparação em pares das seqüências obtidas mostrou serem idênticas à seqüência H sinense cox1 disponível no banco de dados GenBank™ (Número de adesão: AY350769).

Discussão

Este é o primeiro relato de diagnóstico de infestação humana causada por larvas de H sinense na Europa, em um paciente retornando da Índia. É muito provável que a infestação tenha resultado do contacto com gado infestado ou iaques na região – que é endémica para hipodermose – onde o paciente tinha viajado. Casos humanos de miíase podem ocorrer quando larvas recém nascidas no pêlo de animais infectados entram em contato com as mãos ou braços descalços. 2

Na base dos sintomas clínicos do paciente durante o estágio inicial da infestação, e levando em consideração os resultados obtidos nos diferentes testes diagnósticos, um diagnóstico presuntivo de gnathostomiasis foi inicialmente alcançado, seguido por um de esparganose. Como estas doenças são muito raras em Espanha, os testes serológicos não foram imediatamente disponibilizados, mas foram administrados tratamentos empíricos. As características morfológicas do fragmento de larva extraído cirurgicamente sugeriram uma infestação por Hypoderma spp. A identificação das diferentes espécies de Hypoderma depende do exame das características morfológicas larvares, 16,17 mas o pequeno tamanho do fragmento dificultou a identificação completa. No entanto, a presença de altos títulos de anticorpos anti-H lineatum no soro do paciente (detectados pelo ELISA em diferentes momentos) foi indicativo de infestação por larvas de Hypoderma, suportando a suspeita morfológica anterior de miíase. A avaliação da reactividade cruzada com antigénios de outros membros da subfamília Hypodermatinae, ou seja, Hypoderma bovis, Hypoderma tarandi, Hypoderma diana, e Przhevalskiana silenus (ver Monfray e Boulard 18 ; Boulard et al. 19 ) é útil na realização do ELISA preparado com antígenos H lineatum, mesmo que não sejam endêmicos no país de origem do paciente.

O tratamento repetido com ivermectina parece ser eficaz, uma vez que o paciente rapidamente se tornou assintomático e a contagem de eosinófilos normalizada. A ivermectina é eficaz no tratamento de várias miíases, sendo uma boa alternativa quando a remoção cirúrgica é impraticável. Isto é importante, pois as larvas de Hypoderma podem migrar dentro do corpo para envolver o sistema nervoso central 21 ou, mais frequentemente, para os olhos, onde causam oftalmomíase. 22 No nosso caso, duas larvas parasitárias foram removidas cirurgicamente. Considerando que os inchaços não tinham nenhum orifício de respiração e o tamanho larval, foi feito um diagnóstico de mosca primeiro instar (LI), pronta para muda para segundo instar (LII). Além disso, após a primeira e segunda rodada de tratamento com ivermectina, novos inchaços dolorosos apareceram provavelmente devido a outros parasitas não detectados, e não foi até a terceira rodada de ivermectina que o paciente se tornou assintomático. Embora os casos de miíase humana sejam incomuns na Europa, se os sintomas são indicativos desta doença devem ser tidos em conta pelos médicos que examinam imigrantes e viajantes que regressam de áreas endémicas como Ladakh. Embora a análise serológica seja útil no diagnóstico de larvas de hipoderminas causadoras de miíase em viajantes não expostos previamente à infestação larvar, a identificação molecular é importante. Neste trabalho, a sequência de uma sequência parcial do gene mitocondrial cox1 confirmou o H sinense como sendo o agente causal.

Casos humanos de infestação por Hypoderma spp. foram previamente relatados, sendo o H bovis e H lineatum ou H tarandi os agentes mais frequentemente identificados. 2,22 Relatos de miíases humanas associadas ao H diana ou hipoderma actaeon são excepcionais. 23,H sinense (Pleske 1926 24 ), há muito tempo tem sido considerado sinônimo de H lineatum. 25-27 Recentemente, a validade do H sinense como espécie por direito próprio infectando gado e iaques na China foi demonstrada por métodos moleculares e morfológicos. 28 O seu ciclo de vida endógeno também tem sido descrito. 29 Este é o primeiro relato, entretanto, do H sinense como um agente causal da hipodermose humana. No entanto, dada a dificuldade em estabelecer um diagnóstico correto do caso presente, e a escassez da literatura, parece possível que o diagnóstico possa ter sido facilmente perdido em casos similares anteriores. Ao contrário de outras larvas causadoras de miíase (por exemplo, Gasterophilus spp.), Hypoderma spp. pode simular o seu desenvolvimento larvar (embora sem atingir o terceiro instante de maturidade total) em hospedeiros humanos, muitas vezes com consequências graves. A migração através do esófago 29 pode ter sido responsável pelo desconforto e dor abdominal inicialmente descritos pelo paciente no presente relatório.

Casos humanos causados por espécies de Hypoderma frequentemente mostram uma distribuição sazonal associada ao contacto com o gado no Outono ou Verão anteriores. Miller et al. 30 listaram três características clínicas para auxiliar no diagnóstico de infestação por Hypoderma spp. em humanos: (1) ocorrência sazonal, (2) áreas migratórias transitórias de inflamação, e (3) eosinofilia alta. Os métodos serológicos são úteis no diagnóstico de casos importados de miíase humana em viajantes que retornam de áreas endêmicas. No entanto, a confirmação é requerida pelo exame morfológico das larvas recuperadas e sua identificação molecular.

Os autores agradecem ao Professor Dr Luis Zapatero da Universidade Complutense de Madrid pela sua inestimável ajuda na caracterização morfológica do fragmento parasitário extraído. Agradecemos também ao Centro de Referência Internacional de Gnathostomiasis da Tailândia (Universidade de Mahidol, Bangkok) pela realização da análise serológica do Gnathostoma. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Inovação espanhol e pelo Instituto de Salud Carlos III no âmbito da Rede de Investigação de Doenças Tropicais (RICET RD06/0021/0019).

Declaração de interesses

Os autores declaram não ter conflitos de interesse a declarar.