Fungi examinados
Escovopsioides isolados foram obtidos de jardins de fungos de diferentes espécies de formigas cortadeiras e não cortadeiras coletados em estudos anteriores . Esta coleção compreende 20 isolados obtidos de Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi e Trachymyrmex tucumanus, além das espécies do tipo E. nivea obtidas de Acromyrmex subterraneus subterraneus (Tabela 3). Além disso, um isolado adicional foi obtido de uma colônia de formiga não-cortadora de folhas Apterostigma megacephala encontrada em Parauapebas, Pará, Brasil (Tabela 3). Todos os isolados apresentaram as características morfológicas descritas do gênero Escovopsioides: colônias hialinas em PDA, vesículas terminais e intercalares contendo piálidos lageniformes, conídios hialinos em cadeias longas, aleuroconídios e estruturas semelhantes a clamidósporos.
Os isolados são mantidos como suspensões conidianas a – 80 °C (em glicerol 10%) e em água destilada a 10 °C na coleção do Laboratório de Ecologia Fúngica e Sistemática (LESF), Rio Claro, Estado de São Paulo, Brasil. Todos os isolados foram revividos dos estoques através da inoculação de conídios preservados em meio PDA e incubados por 7 dias a 25 °C, na escuridão. Todos os isolados examinados foram obtidos como culturas monoespóricas.
Caracterização molecular de Escovopsioides
O DNA genômico foi extraído pelo método CTAB a partir de culturas cultivadas em ágar maltado 2% (MA2%) por 5 dias, em escuras. Os genes codificadores para tef1 (primers: EF6-20F e EF6A-1000R), LSU (primers: CLA-F e CLA-R) assim como ITS (primers: ITS5 e ITS4) foram amplificados para todos os isolados. Para tef1, 1 μL de ADN genómico diluído (1:100) foi usado como modelo para amplificação usando illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) sob as seguintes condições: um passo inicial de desnaturação a 94 °C durante 2 min, seguido de 15 ciclos a 94 °C durante 30 s e temperatura inicial de recozimento a 65 °C diminuindo 1 °C por ciclo de recozimento e extensão final a 72 °C durante 1 min. Foi realizado um segundo passo de PCR: 94 °C durante 30 s, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s e um passo final de extensão a 72 °C durante 1 min. Para ITS, 2 μL do DNA genómico diluído (1:100) foram usados como modelo para PCR, seguindo as condições descritas em Schoch et al. : 94 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min e um passo final de extensão a 72 °C durante 2 min. Para LSU, 2 μL de ADN genómico diluído (1:100) foram usados para PCR, seguindo as condições descritas em Augustin et al. : 95 °C durante 2 min, 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 62 °C, 90 s a 72 °C e 5 min de extensão a 72 °C. Os produtos PCR foram corados com GelRed™ (Biotium) e visualizados sob UV após electroforese em gel de agarose a 1%.
Amplicons foram purificados com o Gel SV Wizard® e o Kit do Sistema de Limpeza PCR (Promega) seguindo o protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas em NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) e 20 ng de ADN foram sequenciados usando BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) seguindo as instruções do fabricante. Devido ao alto conteúdo de GC na região ITS de Escovopsioides, 5% de DMSO foi adicionado às reações de seqüenciamento. Seqüências para frente e para trás foram geradas no ABI 3500 (Life Technologies) e montadas em contigs no BioEdit v.7.1.3 . As seqüências geradas neste estudo foram depositadas no NCBI-GenBank (arquivo adicional 1: Tabela S1).
Análise filogenética
Além das seqüências geradas neste estudo, as seqüências do tipo espécie (E. nivea) juntamente com seis espécies de Escovopsis descritas e oito fungos pertencentes aos Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma e Lecanicillium) foram recuperadas do NCBI-GenBank. Assim, todo o conjunto de dados utilizado neste estudo compreendeu seqüências de 37 fungos (arquivo adicional 1: Tabela S1).
Para a análise filogenética, as seqüências foram alinhadas em MAFFT . Seqüências de tef1, ITS e LSU foram concatenadas em Winclada v.1.00.08. A inferência Bayesiana foi usada como o algoritmo de reconstrução. O modelo de substituição de nucleotídeos GTR + G e GTR + I + G foi selecionado para tef1 e ITS/LSU, respectivamente, usando AIC no jModeltest2 com um intervalo de confiança de 95%. Assim, análises separadas e independentes do conjunto de dados foram realizadas no MrBayes, cada uma com três correntes aquecidas e uma corrente fria. A amostragem MCMC em cada análise ocorreu em até um milhão de gerações. A convergência das cadeias aquecidas e frias ocorreu quando o desvio padrão das freqüências de partição estava abaixo de 0,01; então os primeiros 25% das gerações foram descartados como burn-in.
Experimentos de cultura dual
Realizamos testes in vitro para verificar o potencial antagônico de Escovopsioides em relação ao fungo cultivado pelas formigas cortadoras de folhas. Selecionamos 13 dos 21 isolados de Escovopsioides (Tabela 3), com base nos seguintes critérios: i) qualquer polimorfismo encontrado no gene tef1; ii) diferentes espécies de formigas associadas; iii) localização geográfica (ou seja, diferentes cidades e locais de coleta). Dois dos isolados selecionados (LESF 596 e LESF 599) já foram avaliados por suas interações com a cultivar fúngica no estudo de Varanda-Haifig et al. . Entretanto, nós replicamos este ensaio para comparar com outros isolados de Escovopsioides.
O fungo Leucoagaricus gongylophorus FF2006 cultivado pela espécie de formiga Atta sexdens rubropilosa foi usado nos experimentos de dupla cultura. Esta estirpe é mantida em slants de ágar por transferências sucessivas a cada 24 dias a 25 °C. A produção de gongylidia por esta estirpe é verificada em cada ciclo de transferência. Este fungo foi cultivado em meio PDA e incubado a 25 °C durante 14 dias, na escuridão. Após este período, fragmentos miceliais (8 mm de diâmetro) foram transferidos para novas placas de Petri (90 × 15 mm) também contendo PDA a uma distância de 1,5 cm da borda. Estas placas foram incubadas a 25 °C durante 14 dias, na escuridão. Em seguida, fragmentos de micélio (8 mm de diâmetro) de Escovopsioides, previamente incubados em PDA, foram inoculados a uma distância de 3 cm do fungo mutualista. Para comparar os efeitos de Escovopsioides no crescimento do micélio da cultivar fúngica com os efeitos causados por outros fungos, utilizamos um Escovopsis sp. isolado (LESF 19) dos jardins de fungos de Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasil). Este isolado foi obtido através da inoculação de pequenos pedaços dos jardins de fungos em PDA suplementado com cloranfenicol. As placas de controle foram inoculadas com o mesmo fungo mutualista, entretanto, nenhum Escovopsioides ou Escovopsis foram inoculados. Todas as placas foram incubadas durante 14 dias a 25 °C, na escuridão. Cada combinação de Escovopsioides, Escovopsis e o fungo mutualista foi realizada em dez placas. As placas experimentais e de controle foram escaneadas em intervalos de 0, 2, 3, 5, 7, 10 dias, em um scanner HP Deskjet F2050. As imagens foram utilizadas para medir a área de crescimento da colônia (cm2) do fungo mutualista no ImageJ v. 1.38 .
As áreas de crescimento micelial de L. gongylophorus nos experimentos de dupla cultura foram analisadas utilizando ANOVA mista bidirecional, com isolados fúngicos (Escovopsioides e Escovopsis) versus o controle como variável entre sujeitos, e o tempo (dias) como variável dentro dos sujeitos, considerando assim as medidas de repetição do tempo nos tratamentos. Os dados foram verificados quanto à normalidade e homogeneidade das variâncias, utilizando os testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente. Devido às violações destes critérios, os dados foram transformados utilizando o log ou raiz quadrada quando necessário. Comparações múltiplas com diferentes fungos filamentosos foram realizadas utilizando o teste t com correção de Bonferroni.
Para comparação entre isolados, a área de crescimento micelial de L. gongylophorus em contato com os isolados de Escovopsioides foi dividida pela área média do seu controle no 10º dia. Os dados foram verificados quanto à normalidade e homogeneidade das variâncias. Foi realizada ANOVA unidirecional com a área obtida no 10º dia entre todos os fungos testados, com comparações entre os diferentes tratamentos realizados através do teste post-hoc Tukey-HSD. Foram realizadas análises estatísticas no R v. 2.12.1 .
Bioensaios sobre fragmentos de fungos em jardins na ausência de trabalhadores
Leucoagaricus gongylophorus é cultivado em colônias de formigas atênicas em jardins de fungos. Para determinar se Escovopsioides pode se desenvolver no jardim de fungos sem os possíveis efeitos protetores dos trabalhadores, realizamos bioensaios utilizando fragmentos deste substrato livres de formigas. Os fragmentos de fungos de jardim foram obtidos a partir de uma colónia de A. sexdens rubropilosa madura e saudável mantida no Centro de Estudos de Insectos Sociais (UNESP, Rio Claro). Fragmentos de jardim de fungos de 2 cm3 privados de formigas e ninhadas foram colocados em pratos Petri estéreis com algodão umedecido nas bordas (seguindo Elizondo-Wallace et al. ). Antes de realizar os experimentos, placas foram mantidas por 1 dia a 25 °C para procurar formigas que possivelmente permaneceram nos fragmentos.
Preparamos uma suspensão de 10 mL de 0,05% Tween 80 com massa micelial e conidia de cada um dos 12 Escovopsioides (o isolado LESF 591 não foi usado neste experimento) e um Escovopsis isolado usado nos experimentos de dupla cultura. Esta suspensão foi filtrada duas a três vezes seguindo o método de Newmeyer para separar as conídias dos fragmentos hifálicos presentes na suspensão. Em seguida, a suspensão foi diluída para 105 a 2,105 conidia mL-1determinada em uma câmara Neubauer. Alíquotas de 100 μL de suspensões de conídio foram inoculadas na superfície do fragmento do jardim usando uma micropipeta. A mesma quantidade de solução estéril 0,05% Tween 80 foi adicionada à superfície do jardim no controle negativo. As placas de Petri com jardim de fungos foram mantidas a 25 °C por até 10 dias, com cinco placas utilizadas para cada tratamento e cinco placas para cada controle respectivo. O possível desenvolvimento de hifas dos fungos inoculados foi observado diariamente num estereomicroscópio (EZ4, Leica). A conidiação de Escovopsioides nos jardins dos fungos foi observada tomando fragmentos de micélio crescendo nos jardins e montados em água e observados sob o microscópio (DM500, Leica).
Dados de crescimento e conidiação nos jardins dos fungos foram pontuados como: nenhum crescimento (pontuação 0), crescimento observado apenas no estereomicroscópio (pontuação 1), crescimento macroscópico (pontuação 2) e conidiação (pontuação 3) durante 10 dias de monitoramento (arquivo adicional 1: Figura S1). Observamos a conidiação somente após crescimento macrocóspico fúngico nos jardins de fungos. A soma total dos escores de cinco placas de Petri em cada dia foi obtida e transformada em termos de porcentagem do total máximo possível para comparações diretas.
Efeitos de Escovopsioides em jardins com trabalhadores
Ant trabalhadores têm um papel importante na defesa da colônia contra patógenos e micróbios indesejáveis nos jardins de fungos . Assim, fizemos experiências para verificar a influência de trabalhadores em jardins de fungos inoculados com conídios dos mesmos fungos usados nos bioensaios em jardins de fungos na ausência de trabalhadores de formigas (12 Escovopsioides isolados e 1 Escovopsis isolado).
Bioensaios usando colónias de formigas rainha-direita são desafiantes devido ao grande número de colónias que este tipo de experiência exigiria. Assim, realizamos bioensaios com fragmentos de jardins contendo trabalhadores para avaliar os efeitos dos isolados fúngicos in vivo. Embora esta instalação experimental não represente o que ocorre nas colónias naturais, mostrou informações indicativas sobre a acção defensiva dos trabalhadores contra os fungos testados. Este bioensaio foi adaptado seguindo o método de Elizondo-Wallace et al. . Foram utilizados recipientes plásticos com uma pequena camada de gesso no fundo para evitar a dessecação dos jardins dos fungos. Cerca de 20 cm3 de jardim de fungos da mesma colónia utilizada na experiência anterior foram colocados nos recipientes plásticos. A instalação experimental compreendeu um total de 84 recipientes, de modo que os tratamentos com conídios dos 13 fungos e o controle tinham seis recipientes cada um. Selecionamos formigas operárias com diâmetro de cápsula cefálica entre 1,0 e 1,6 mm, depois foram colocadas 50 dessas operárias em cada recipiente. Trabalhadores com menos de 1,0 mm não foram contados, e trabalhadores com mais de 1,6 mm foram excluídos. Este procedimento foi adotado para permitir homogeneidade entre os seis recipientes de cada tratamento, bem como entre os tratamentos, pois os trabalhadores no intervalo entre 1,0 e 1,6mm têm uma significativa atividade de limpeza. A superfície interna do recipiente foi revestida com Teflon® para evitar a fuga das formigas.
Os recipientes foram incubados a 25 °C durante 3 dias para estabilizar os jardins dos fungos. As suspensões de Conidia foram obtidas como descrito acima. Um total de 1 mL de suspensão de conídio foi pulverizado na superfície dos jardins de fungos utilizando um pulverizador. Os jardins de fungos no controle negativo foram pulverizados com apenas 1 mL de solução estéril 0,05% Tween 80.
Os experimentos foram monitorados após 0, 5 e 10 dias de inoculação para verificar a saúde dos jardins de fungos. Este parâmetro foi baseado num sistema de pontuação, no qual jardins saudáveis receberam pontuação 0, jardins parcialmente degradados receberam pontuação 1 e jardins completamente degradados (“infectados”) receberam pontuação 2. A remoção dos pedaços de fungos dos jardins e a alocação para as lixeiras foi o principal sinal de deterioração do jardim que examinamos (ver arquivo adicional 1: Figura S2). Os escores obtidos dos seis recipientes de cada experiência, nos 3 dias de observação, foram comparados usando o teste Friedman.
Para verificar a presença dos isolados de Escovopsioides nos jardins de fungos nos dias 0, 5 e 10 após o tratamento, os fragmentos foram removidos dos jardins e inoculados em MA2% suplementados com 150 μg mL- 1 de cloranfenicol. As placas foram incubadas a 25 °C durante 7 dias, na escuridão. Cinco placas com um fragmento de jardim foram utilizadas para cada um dos seis recipientes de cada tratamento, totalizando 30 placas por tratamento. Os fragmentos com crescimento positivo foram contados e a presença a longo prazo dos fungos inoculados nos jardins dos fungos foi testada utilizando o teste Exacto de Fisher. Nesta análise comparamos a proporção de fragmentos infectados com conídios fúngicos (Escovopsioides e Escovopsis) versus o controle sem conídios em cada dia de experimento. Também comparamos os diferentes tratamentos com fungos inoculados entre si em cada dia de experimento.