Essencialmente, a cultura celular envolve a distribuição de células em um ambiente artificial (in vitro) que é composto dos nutrientes necessários, temperatura ideal, gases, pH e umidade para permitir que as células cresçam e proliferem.

• In vivo – Quando o estudo envolve entidades biológicas vivas dentro do organismo.

• In vitro – Quando o estudo é realizado utilizando entidades biológicas (células, tecidos, etc.) que tenham sido isoladas do seu ambiente biológico natural. Por exemplo, tecido ou células isoladas do fígado ou rim.

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Onde pedaços de tecido podem ser colocados em cultura apropriada para produzir células que podem então ser usadas para cultura (explicação da cultura), células de tecidos (tecido mole) podem ser obtidas através de reações enzimáticas. Enzimas como a tripsina e o pronome são usadas para quebrar o tecido e liberar as células desejadas.

Quando células foram obtidas diretamente do organismo/tecido animal (ou mesmo tecido vegetal) através de técnicas enzimáticas ormecânicas, tais células são referidas como células primárias. Entretanto, células que continuam a proliferar indefinidamente (após a primeira subcultura) sob condições especiais são referidas como linhas de células.

Estas células em particular têm sido passadas por um longo período de tempo, o que as faz adquirir traços genotípicos e fenotípicos homogêneos (similares).

Morfologia

Com base na sua aparência, as células em cultura podem ser categorizadas em três grupos principais:

• Fibroblástico – Isto inclui células que tendem a ser bipolares/multipolares com formas alongadas. Estas células são fixadas ao substrato à medida que crescem.

• Epiteliais – As células epiteliais atingem uma forma poligonal com dimensões regulares. Embora tendam a crescer em manchas discretas, estas células também crescem presas ao substrato.

Lymphoblast – Estas células são geralmente de forma esférica e não se ligam à superfície do substrato. Como resultado, elas são cultivadas em suspensão.

* Para placas sólidas, são usados agentes solidificantes (como o ágar) onde o meio líquido é usado com ágar.

Importância da Cultura Celular

A cultura de células é uma técnica importante tanto em biologia celular como em biologia molecular, dado que proporciona a melhor plataforma para o estudo da fisiologia e bioquímica normal das células. Uma célula é a unidade básica estrutural, funcional e biológica de todos os seres vivos.

Para suportar um organismo ou tecidos dados, é importante entender como funcionam as células. Através da cultura celular, isto torna-se possível especialmente devido ao facto de as células primárias se assemelharem às células parentais do organismo/tecido.

O que se aprende sobre as células in vitro é representativo do que está a acontecer com o organismo/tecido. Isto torna a cultura de células significativamente importante para o desenvolvimento de vacinas, rastreio (medicamentos, etc.) e diagnóstico de doenças/doenças.

Dado que diferentes tipos de células requerem ambientes diferentes para a proliferação, existem diferentes tipos de meios utilizados para a cultura, tais como meios sem soro e meios contendo soro entre outros.

Após os requisitos certos terem sido fornecidos, as células irão aumentar em número e podem formar colónias, que podem então ser facilmente vistas e identificadas. No entanto, tudo isto requer que o objectivo do procedimento seja compreendido.

Pós uma boa compreensão do que o procedimento pretende alcançar, torna-se mais fácil preparar a cultura com os componentes certos. Ao entender o objetivo do procedimento, o pesquisador saberá se deve preparar um meio seletivo (que permita o crescimento de células específicas) meios ordiferenciais (que permitam o crescimento de diferentes tipos de células).

Cultura de Células Primárias

Cultura de Células é um processo onde as células (células animais ou vegetais) são removidas do organismo e introduzidas em um ambiente artificial com condições favoráveis para o crescimento. Isto permite aos pesquisadores estudar e aprender mais sobre as células.

Existem três tipos principais de cultura de células, que incluem:

• Cultura de células primárias
• Cultura de células secundárias, e
• Linha celular

Aqui, vamos focar na cultura de células primárias.

Existem dois tipos de células primárias:

Células Aderentes – Também referidas como células dependentes de ancoragem, estes são os tipos de células que necessitam de fixação para o crescimento. Células aderentes são imóveis, e obtidas de tais órgãos askidney.

Células de suspensão – Estes são os tipos de células que não necessitam de fixação para crescer. Elas são, portanto, como células independentes de ancoragem, e incluem tais células como linfócitos encontrados no sistema sanguíneo.

Em cultura primária de células, as células obtidas de tais tecidos parentais (tecidos vivos) como o fígado e o rim, são introduzidas em meios adequados para o crescimento. Uma vez que as células tenham sido obtidas, elas podem ser cultivadas como cultura de explantes, suspensão ou monocamada.

* Em cultura de células primárias, as células devem ter sido obtidas do tecido parental/vivo. Ou seja, não são de outro processo de cultura.

Antes de serem cultivadas, as células são primeiramente submetidas a um tratamento enzimático para dissociação. Entretanto, tem que ser por um período de tempo aminimal para evitar danificar ou matar as células. Uma vez obtidas as células individuais, elas são então adequadamente cultivadas em meios para permitir que elas cresçam (dividir) e atinjam os números desejados.

Inicialmente, a cultura tende a ser heterogênea, pois é composta de diferentes tipos de células obtidas do tecido.Embora isto possa ser mantido através do processo in vitro (numa cultura em meios adequados) isto seria apenas por um período de tempo limitado.

Através do processo de transformação, as células primárias podem ser usadas por um longo período de tempo, mudando a cultura ao longo do tempo. Estas células são referidas como linhas de células contínuas.

No entanto, as células primárias são tipicamente preferidas às células contínuas devido ao facto de serem mais semelhantes (fisiologicamente) às células invivas (células do tecido vivo). Além disso, as linhas de células contínuas podem sofrer certas alterações (alterações fenotípicas e genotípicas) que resultariam em discrepâncias durante a análise. Como tal, elas não podem ser usadas para determinar o que está acontecendo com as células in vivo. É por esta razão que as células primárias são preferidas.

Dado que as células primárias se assemelham significativamente às células obtidas de tecido vivo, elas são importantes para fins de pesquisa, pois podem ser usadas para estudar suas funções, regulações metabólicas, fisiologia celular, desenvolvimento, defeitos e condições que afetam o tecido de interesse.

Também são utilizadas para fins como a produção de vacinas, rastreio de medicamentos de engenharia genética, testes de toxicidade e diagnóstico pré-natal, entre outros.

Meios de Cultura Celular

Nas técnicas de cultura celular, as células (ou tecidos) são removidas de uma planta ou animal e introduzidas num novo ambiente artificial que possa suportar a sua proliferação (sobrevivência e crescimento).

Algumas das exigências de tal ambiente para a proliferação das células incluem:

• Um substrato (fonte de nutrição)
• Ideal de temperatura(controlada)
• Médio de crescimento, e
• Ideal pH entre outros

Aqui, vamos focar no meio (cell culturemedia)

Embora existam diferentes tipos de culturemedia (para diferentes tipos de células), eles são tipicamente compostos de:

• Glucose
• Aminoácidos
• Vitaminas
• Sais inorgânicos
• Factores de ligação Etc.

Existem dois tipos principais de meios de cultura. Estes incluem:

Meios naturais – Os meios naturais de cultura são compostos por fluidos biológicos que ocorrem naturalmente. Embora este tipo de meios possa ser utilizado para uma variedade de células, a sua maior desvantagem é que pode faltar-lhe os componentes exactos requeridos por determinadas células, o que pode afectar grandemente a reprodutibilidade.

Meios artificiais – Também referidos aos meios sintéticos, os meios artificiais referem-se ao tipo de meios que são produzidos pela adição de nutrientes como vitaminas, gases (oxigénio e dióxido de carbono) e proteínas, entre outros. Estes nutrientes orgânicos e inorgânicos são adicionados de forma a satisfazer as necessidades específicas de determinadas células, e assim fornecer o ambiente ideal para o seu crescimento.

Como tal, eles podem ser utilizados para uma série de fins, incluindo:

• Prover a sobrevivência imediata das células
• Permitindo a sobrevivência prolongada das células
• Permitindo o crescimento indefinido das células
• Proporcionando funções especializadas

Por outro lado, a cultura pode ser categorizada como

Meios selectivos- Este é um tipo especial de meio que só permite o crescimento de certas células. Por exemplo, o ágar sangue (usado para isolar Streptococcus & Espécie de Moraxella) pode ser transformado em meio asséptico adicionando antibióticos.

Meios diferenciados- Este tipo de meios permite que diferentes tipos de células/microorganismos cresçam dependendo do seumetabolismo.

Como mencionado acima, diferentes tipos de meios sintéticos são preparados de forma a fornecer o ambiente ideal para a proliferação de determinadas células. Por esta razão, os meios sintéticos podem ser divididos em quatro grandes categorias.

Estes incluem:

Soro contendo meios – Nestes tipos de meios,o soro (soro fetal bovino) é usado como um portador de nutrientes e fatores de crescimento entre outros que tendem a ser insolúveis em água.

Meios livres de soro – Estes tipos de meios são produzidos tipicamente com a finalidade de suportar um tipo de cultura de uma única célula, fornecendo nutrientes especificados e outros factores necessários para o tipo de célula. Neste meio, o soro está ausente porque apresenta algumas desvantagens e pode resultar em má interpretação dos resultados imunológicos.

Meios quimicamente definidos – Como o nome sugere, este tipo de meio é composto de ingredientes orgânicos e inorgânicos puros e livres de contaminação. Os constituintes deste tipo de meio são tipicamente produzidos através de engenharia genética em bactérias/origem.

Meios livres de proteínas – Meios livres de proteínas – Falta tipicamente qualquer tipo de proteína. É amplamente utilizado para promover o crescimento superior das células, bem como a expressão de proteínas, além de facilitar a purificação de qualquer produto expresso.

Alguns dos principais componentes da cultura de células incluem:

• Nutrientes – fornecidos para bypeptídeos e amino-ácidos, que são os blocos de construção das proteínas
• Carboidratos para energia
• Minerais essenciais como cálcio, magnésio, fosfatos e ferro, entre outros agentes tamponantes, tais como acetatos para estabilizar os meios de cultura
• Vitaminas
• Indicadores de mudança de pH como o vermelho de fenol

Meios de cultura de células são usados para a proliferação de células, que podem então ser identificadas e estudadas. Como tal, pode ser utilizado para vários fins, incluindo a educação, diagnóstico e tratamento de uma doença, entre outros.

Suspensão celular

Em métodos de cultura, a suspensão celular refere-se a um tipo de cultura em que as células são suspensas num meio líquido.

Para obter células únicas, um calo friável (pequeno tecido que se desfaz facilmente) é colocado em meio líquido agitado (a agitação permite a troca gasosa ao contrário do meio sólido), quebrando-o. Isto permite a libertação de células simples, que são depois transferidas para outro freshmedium.

Culturas em suspensão celular têm uma grande vantagem sobre as células estacionárias dado que permite que as células sejam banhadas uniformemente. Além disso, dado que o meio tende a ser agitado, permite a aeração do meio, fornecendo gases para as células. Dado que o meio é uma suspensão, também se torna fácil manipular o conteúdo da cultura.

Como qualquer outra cultura, a cultura de células em suspensão tem que estar sob condições controladas, provando que as células com um ambiente ideal para proliferar. Uma vez que atingem cerca de 80% de confluência, é tempo de subcultura para garantir a continuidade do crescimento adequado.

* 80% de confluência refere-se ao estado em que 80% da superfície da cultura é coberta com as células em crescimento.

Em alguns casos, as células em suspensão podem não chegar à superfície plástica do frasco de cultura ou mesmo formar tufos. Em tais casos, uma pipeta pode ser usada para colher estas células e expulsá-las para a superfície do frasco e, portanto, para longe da superfície plástica. Isto ajuda a manter as células únicas dado que elas não aderem à superfície plástica.

Sangue vermelho Suspensão

• (esquerda: sem hemólise) suspensão de hemácias vermelhas (0,5% de hemácias ovinas em soro fisiológico), parece vermelho e opaco.
• (meio: sem hemólise) hemácias sedimentadas espontaneamente por 60 min. Note que o sobrenadante não é colorido.
• (direita: hemólise) Suspensão de hemácias tratada com a hemolisina de S. pyogenes a 37C por 30 min, tornam-se transparentes por hemólise.

Veja mais sobre os glóbulos vermelhos

Contagem de células

Contagem do número de células em uma suspensão é um processo que envolve o uso de uma coloração. Por exemplo, quando o azul de tripano é usado, ele penetra na membrana celular das células mortas, mas não nas células vivas.

As células são então gentilmente expelidas para um hemocitômetro (contém a câmara de contagem) sob o deslizamento da tampa e observadas sob um microscópio. As células são então contadas dentro de um determinado número de quadrados para cálculos.

Significância

Este método é largamente preferido devido ao facto de permitir que as células sejam suspensas numa solução em vez de serem mantidas num meio sólido. Aqui, portanto, torna-se mais fácil manipular o conteúdo, impedindo a formação de aglomerados. Com as suspensões celulares, é muito mais fácil observar células únicas sob o microscópio.

Neste caso, é possível não só estudar a estrutura das células, mas também observar o quão bem elas se diferenciaram; visualizando células mortas e vivas sob o microscópio.

Protocolo de cultura de células

Protocolos de cultura de células destinam-se a garantir que os procedimentos de cultura sejam realizados de acordo com os padrões exigidos. Isto não é apenas para prevenir a contaminação das células, mas também para assegurar que os próprios investigadores estão protegidos de qualquer forma de contaminação.

Além disso, espera-se que a natureza do trabalho esteja de acordo com as orientações éticas apropriadas. Portanto, antes de mais nada, é essencial assegurar que o procedimento doentio esteja em conformidade tanto com as linhas de orientação ético-médicas como com as de experimentação animal. Isso porque ir contra essa legislação e diretrizes pode resultar em penalidades pesadas e até mesmo no fechamento do laboratório.

Antes de qualquer trabalho começar, realize o seguinte procedimento:

• Certifique-se de que o trabalho é higienizado (usando 70% de etanol)
• Aplique sempre um novo par de luvas. Se um par de luvas tiver que ser usado para outro procedimento de cultura de células, elas devem ser higienizadas usando etanol a 70% e deixadas secar ao ar.
• Todos os equipamentos que tenham sido retirados do armário também devem ser higienizados para evitar qualquer contaminação
• Os equipamentos como pipetas, frascos de vidro e plásticos a serem usados para o procedimento devem ser autoclavados

Embora haja uma grande variedade de meios de cultura de células, é importante ter em mente que as culturas de células, e particularmente as culturas de células primárias, são facilmente propensas a contaminação, além do risco de conterem vírus não detectados. Por este motivo, todo o material deve ser considerado potencialmente infeccioso para evitar infecções.

Além disso, por razões de segurança, a cultura de células deve ser realizada no capô de fluxo laminar apropriado, onde o ar é direcionado para longe do pesquisador.

Protocolos para preparação da cultura de células

Verifica sempre a informação no recipiente para garantir que o meio é apropriado para a cultura de células,

Preparado, a cultura de células deve ser mantida sob a faixa de temperatura recomendada,

Monitorar a cultura a cada 30-48 horas e verificar a confluência (quando as células cobrem completamente a superfície da cultura) – No entanto, isto depende em grande parte do tipo de células.

Após o procedimento estar concluído e as células terem sido analisadas, a cultura deve ser adequadamente descartada. Aqui, é importante ter muita cautela, uma vez que até este momento, as células já proliferaram e aumentaram em número. Além disso, há grandes chances da amostra ter sido contaminada, o que aumenta os riscos de causar infecções ao pesquisador se não for tratada adequadamente.

Eliminação

• Para itens como bisturis, lâminas de vidro e lâminas de cobertura entre outros, a eliminação da contaminação pode envolverautoclavagem a 121 graus Celsius e 15 psi (pressão) por pelo menos 30 minutos. No entanto, se eles forem descartados, é importante que sejam colocados em um saco plástico e no recipiente apropriado para serem incinerados mais tarde.
• Com resíduos líquidos, a desinfecção química é um dos melhores métodos através dos quais o resíduo pode ser desativado. Produtos químicos como lixívia podem ser utilizados para este fim antes de despejar o líquido pelo ralo da pia.
• Para os resíduos sólidos, eles são recolhidos num saco plástico para incineração. Por outro lado, oycan primeiro é autoclavado antes de ser incinerado.

Conclusão

Em geral, a cultura de células, quer envolva a utilização de uma suspensão ou de um meio estacionário, envolve o crescimento de células em ambiente anartificial com condições favoráveis. Enquanto que a ação enzimática pode ser usada para obter células para cultura, é o método de desagregação mecânica que é mais preferido, uma vez que fornece uma forma mais simples e menos traumática de obter células.

Este método envolve simplesmente o corte de um tecido em pedaços mais pequenos dos quais as células derramadas são então coletadas. Além disso, a técnica dos explantes primários pode ser usada para obter as células. Entretanto, este método é mais útil para a desagregação de pequenas quantidades de tecido.

Embora qualquer célula possa ser usada em culturas para observar seu comportamento, os tecidos embrionários são preferidos (para células primárias) ascomparados com células adultas porque fornecem células que são mais viáveis e proliferam mais rapidamente.

Aqui, também é importante assegurar que as células sejam de maior quantidade, dado que sua taxa de sobrevivência tende a ser menor incomparação com as sub-culturas. I

n para aumentar o sucesso das culturas, também é importante assegurar que os danos às células sejam minimizados tanto durante a coleta como durante o processamento das células. Isto, além de usar o meio apropriado para as células em questão.

Em todas as mesmas linhas, dê uma olhada nos tipos e técnicas de cultura de tecidos.

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Como também informação sobre divisão celular, diferenciação celular e coloração celular e ganhar alguma percepção da teoria celular.

Para os mais avançados e uma grande leitura é a Biologia Molecular da Célula. Assim como aprender sobre Citoquímica.

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