Testes de Amplificação de Ácido Núcleico &Sua Performance

Os ensaios diagnósticos convencionais, tais como cultura e imunoensaio enzimático usados anteriormente para a detecção de clamídia careciam de sensibilidade, organismos viáveis necessários, equipamento esterilizado, condições de transporte fastidioso e amostragem invasiva, incluindo exame especular em mulheres e esfregaços uretrais em homens, necessitando de um profissional de saúde treinado e um ambiente clínico com uma sala de exames. Com o advento das tecnologias de teste de amplificação de ácido nucleico (NAAT) para testes de clamídia, temos agora acesso a testes mais sensíveis que podem geralmente permitir o uso de amostras autocolhidas de material coletado mais longe do local original da infecção (por exemplo, urina para uma infecção cervical), que pode consequentemente conter menos organismos do que em esfregaços coletados pelo médico. Além disso, as condições de transporte são menos críticas para o desempenho do teste, o que significa que essas amostras podem ser coletadas fora de um ambiente clínico tradicional e, em alguns casos, podem até ser enviadas pelo correio para o laboratório de diagnóstico.

Embora o advento dos testes NAAT tenha revolucionado o teste de clamídia, há uma série de fatores que devem ser considerados ao interpretar os resultados de um estudo ou selecionar um teste para uso. Isso inclui compreender como o teste foi originalmente avaliado para uso, estar ciente do que significa um resultado positivo ou negativo e quão confiável ele é, e apreciar como o desempenho do teste pode diferir em outros grupos populacionais.

Como o teste foi avaliado para uso?

Sensibilidade e especificidade são as duas principais estatísticas usadas para avaliar o desempenho de um teste de triagem em comparação com um método padrão-ouro. Sensibilidade é a probabilidade de um teste diagnóstico ser positivo, dado que o diagnóstico verdadeiro é positivo; e especificidade é a probabilidade de o teste diagnóstico ser negativo, dado que o diagnóstico verdadeiro é negativo. Os melhores testes de triagem têm alta sensibilidade e alta especificidade. A baixa sensibilidade leva a resultados falso-negativos elevados e a baixa especificidade leva a resultados falso-positivos elevados. Foi manifestada preocupação quanto à validade da sensibilidade e especificidade publicadas dos NAATs para a clamídia, uma vez que não existe actualmente um teste padrão de ouro. Tradicionalmente, a cultura da clamídia tem servido como padrão ouro e acredita-se que tenha quase 100% de especificidade; contudo, quando comparada com os NAATs, a cultura tem demonstrado uma sensibilidade muito menor, uma vez que apenas detecta organismos vivos. Como resultado, estimar a sensibilidade e especificidade de um novo teste, comparando o seu desempenho com a cultura, pode resultar em estimativas tendenciosas de sensibilidade e especificidade do novo teste. Numa tentativa de minimizar este viés, a abordagem de análise discrepante foi inicialmente proposta para avaliação dos NAATs para clamídia, realizando outro NAAT no espécime para julgar os resultados “verdadeiros”. Se este teste adicional fosse positivo, então o resultado positivo era considerado como sendo um verdadeiro positivo. As preocupações foram levantadas porque este método pode levar a sobrestimações de sensibilidade e especificidade; no entanto, a sua utilização diminuiu. Em seu lugar, outra abordagem de estimativa foi proposta, o algoritmo de estado do paciente infectado (PISA). Foram propostas várias versões do PISA, mas essencialmente, o PISA envolve a utilização de múltiplos testes para definir o “padrão ouro”, e a sensibilidade e especificidade de um novo teste é então comparada com este. No entanto, foi demonstrado que o PISA também pode produzir estimativas tendenciosas dos parâmetros de desempenho do teste. Em uma série de cenários simulados conduzidos por Hadgu e colegas, nenhum dos 95% de IC para estimativas de sensibilidade e prevalência baseadas no PISA continha os valores verdadeiros. Além disso, as estimativas de sensibilidade e especificidade baseadas no PISA mudam acentuadamente à medida que a verdadeira prevalência se altera. Técnicas mais avançadas de modelagem estatística, como a modelagem de classe latente, foram propostas como uma alternativa para avaliar o desempenho do teste. Enquanto o PISA é endossado pela FDA dos EUA para avaliar os testes de diagnóstico da clamídia, tanto o PISA como a modelagem da classe latente estão agora sendo usados para avaliação do teste.

Como a fiabilidade é um resultado positivo?

Reprodutibilidade dos NAATs, uma medida do grau em que os resultados de um teste permanecem consistentes sobre testes repetidos da mesma amostra sob as mesmas condições de um ensaio de diagnóstico ou rastreio, é de primordial importância. Os NAATs têm tido problemas consideráveis de reprodutibilidade no passado. Há cerca de uma década, os Laboratórios Abbott (IL, EUA) tiveram muitos problemas publicados que acabaram por levar à descontinuação do teste do mercado. Em uma revisão da reprodutibilidade da clamídia NAAT, Hadgu et al. descobriram que, para estudos que utilizaram PCR, entre 37,5 e 96,7% dos resultados positivos foram confirmados; e para amplificação de deslocamento de fios (SDA), entre 79,3 e 93,7% dos resultados positivos foram confirmados. Outro estudo de Schachter e colegas avaliou a reprodutibilidade e constatou que 96,7% dos resultados positivos usando PCR, 83,8% de SDA e 97,7% de TMA foram confirmados. Hadgu et al. observaram que muitos dos problemas de reprodutibilidade nos NAATs parecem ocorrer em amostras de baixo nível de positividade e, como resultado, alguns autores recomendam o re-teste de amostras de resultados positivos de baixo nível como forma de reduzir o número de resultados potencialmente falso-positivos. Outros tratam estas amostras de baixo nível positivo como verdadeiros positivos e não sentem que é necessário um novo teste, porque argumentam que “não repetir um teste positivo não significa que o resultado do teste inicial foi um falso positivo”. Entretanto, dado o potencial impacto de um teste de clamídia positivo em um indivíduo e o potencial impacto que um diagnóstico positivo pode ter em relacionamentos, resultados positivos devem ser interpretados levando em consideração a história sexual e o quadro clínico do indivíduo e, quando houver qualquer dúvida, um novo teste deve ser considerado.

Também deve ser lembrado que, ao interpretar um resultado positivo, os NAATs não requerem organismos viáveis. Os NAATs têm sensibilidade analítica superior, pois podem potencialmente produzir um sinal positivo a partir de tão pouco quanto uma única cópia do DNA ou RNA alvo na reação. Contudo, este elevado nível de sensibilidade pode criar problemas porque, embora um resultado NAAT positivo possa reflectir uma infecção clínica, o teste também pode estar a amplificar organismos mortos ou ser positivo como resultado de contaminação superficial (incluindo contaminação do recipiente no caso de amostras autocolhidas) e, portanto, produzir um diagnóstico falso-positivo. Subsequentemente, é importante que um indivíduo não seja submetido a um novo teste demasiado rápido após o tratamento da infecção. Estudos têm investigado a dinâmica da depuração do ADN ou RNA da clamídia após o tratamento para a infecção por clamídia. Um estudo com 115 mulheres diagnosticadas com clamídia descobriu que, 7 e 14 dias após o tratamento, 54 e 21% das mulheres, respectivamente, ainda tinham rRNA detectável nos seus esfregaços vaginais autocolhidos. Outro estudo recente seguiu prospectivamente 59 infecções cervicais e/ou retais tratadas em 52 mulheres e homens, e avaliou a presença de DNA plasmídeo de clamídia e rRNA através de medidas sequenciais múltiplas ao longo de um período de 8 semanas. Este estudo constatou que uma elevada proporção (42%) de infecções por clamídia teve resultados positivos em pelo menos uma das amostras colhidas após 3 semanas e resultados frequentes de clamídia positiva intermitente ao longo do tempo. Embora a possibilidade de uma nova infecção não possa ser excluída em nenhum destes estudos, os seus resultados sugerem que um novo teste demasiado cedo após o tratamento pode levar a um diagnóstico falso-positivo. As diretrizes atuais de tratamento de doenças sexualmente transmissíveis do CDC recomendam contra um teste de cura entre 3-4 semanas após o tratamento, e agora recomendam que mulheres e homens não grávidos diagnosticados com clamídia devem ser testados novamente 3 meses após um diagnóstico positivo.

Como é confiável um resultado negativo?

Resultados falso-negativos devido a mutações no gene alvo dos ensaios comerciais é outra questão que pode impactar o desempenho do teste e destaca a importância da vigilância contínua para garantir que qualquer queda nas taxas de diagnóstico de clamídia não seja devida à introdução de mutações nas cepas que circulam atualmente na população. Um exemplo disso é a variante da clamídia identificada na Suécia em 2006, com uma eliminação de 377 pares de base no plasmídeo críptico. Esta descoberta ocorreu após a inesperada diminuição de 25% nas infecções por clamídia entre novembro de 2005 e agosto de 2006 no condado de Halland, sudoeste da Suécia. Isto teve ramificações importantes no diagnóstico das infecções por clamídia, dado que vários ensaios de clamídia disponíveis comercialmente foram afectados.

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Exame de alteração do desempenho do teste em diferentes grupos populacionais?

Outra estatística importante usada para descrever o desempenho de um teste diagnóstico é o valor preditivo positivo (PPV). O PPV é a proporção de pessoas que testam positivo para a doença e que realmente têm a doença. Está relacionado com a prevalência da doença na população e, à medida que a prevalência aumenta, o VPP do teste aumenta. Com baixa prevalência, o VPP diminui e a proporção de resultados falsos positivos no teste aumenta. A Figura 2 abaixo mostra a associação entre o VPP e a prevalência para um NAAT com 90% de sensibilidade e diferentes níveis de especificidade. Vale ressaltar que, em estimativas de baixa prevalência, há uma diminuição acentuada do VPP, o que significa altas taxas de diagnósticos falso-positivos. Este número mostra que, com 4% de prevalência e 97% de especificidade, o VPP é aproximadamente 50%, o que significa que metade dos resultados positivos do teste NAAT representarão falsos positivos, enquanto que com 99,5% de especificidade, a proporção de testes positivos que são falsamente positivos cai para 12%.

Existem implicações significativas na saúde pública dos resultados falso-positivos da clamídia. Primeiro, os diagnósticos falso-positivos podem ter danos sociais e psicológicos consideráveis a um indivíduo, bem como ao seu relacionamento, um factor que não deve ser subestimado. Em segundo lugar, as estimativas de incidência e prevalência serão superestimadas, levando a um monitoramento de vigilância tendencioso e resultados de pesquisa; isto também tem implicações para análises de custo-eficácia. Finalmente, resultados falso-positivos inevitavelmente levarão ao tratamento excessivo dos indivíduos.