Simples translocações e inversões desequilibradas (classes A e C): mecanismos de origem

O resultado direto deste estudo é que em 20 das 37 translocações desequilibradas de novo, a duplicação tem uma origem materna (Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2). Como a investigação da origem dos pais não foi informativa ou não foi possível em seis casos (casos 7, 14, 23, 24, 33 e 35), as translocações de novo desequilibradas onde a região duplicada é de origem materna representam 64,5% (20/31) dos casos totalmente informativos. Combinando estes dados com a constatação de que em oito destes casos (casos 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, e 32) três alelos (Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2), dois maternais e um paterno, estavam presentes pelo menos em parte da região de duplicação, o cenário emergente é que em não menos de 25% (8 em 31), o condutor primário para a ocorrência de novas translocações desequilibradas é uma não-disjunção meiótica materna, seguida de um resgate parcial da trissomia do cromossomo supranumerário materno (Fig. 1a). A explicação mais provável para a presença de três alelos dentro da região duplicada, dois maternais e um paterno, seria a não disjunção na meiose materna I (mat-MI) (Fig. 1A.I). Alternativamente, uma recombinação meiótica proximal ou no ponto de quebra da translocação deve ter precedido uma não-disjunção na meiose materna II (mat-MII). Em contraste, nos 12 casos (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 e 37) com o mesmo haplótipo materno duplicado não podem ser excluídos outros mecanismos (Fig. 1b), embora também possam resultar ou da não-disjunção mat-MI (Fig. 1A.I), após um cruzamento telomérico, de acordo com a ocorrência preferencial de cruzamentos teloméricos demonstrada para alguns cromossomos não conjugados (Oliver et al. 2014) ou uma não disjunção materna MII (mat-MII) (Fig. 1A.II), como relatado em vários casos de resgate de trissomia (revisto em Chantot-Bastaraud et al. 2017).

É bem conhecido que o retardamento da anáfase do cromossomo supranumerário seguido pelo seu aprisionamento dentro de um micronúcleo está na base de muitos eventos cromotripsia (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Como consequência, em uma célula filha, o cromossomo supranumerário é eliminado, enquanto na outra, a quebra do material genômico micronuclear, seguida pela re-integração de todos ou alguns fragmentos dentro do núcleo principal pode resultar em uma reorganização massiva do cromossomo original que ou mantém a maior parte de seu material embora reorganizado em uma nova ordem, ou perde algumas de suas porções (Fig. 1a), que porções do cromossoma supranumerário original são perdidas e que são preservadas poderiam depender de eventos estocásticos, da prontidão das extremidades quebradas para se integrarem umas com as outras ou com outras partes do genoma, e/ou da subseqüente seleção de células que podem sobreviver e se multiplicar na presença de desequilíbrios segmentares mínimos. Em teoria, fragmentos cêntricos podem ser preservados como cromossomos marcadores supranumerários por sua circularização com formação de cromossomos anelares, superando assim a ausência de sequência telomérica em ambas as extremidades. A preservação dos fragmentos supranumerários intersticiais acêntricos requer a formação de um neocentrômero também ou, alternativamente, a captura do fragmento por outro cromossomo com a formação de uma translocação insercional de novo. De fato, Kato et al. (Kato et al. 2017) relataram recentemente uma instância de translocação intersticial de novo derivado por cromotripsia de um cromossomo supranumerário presente em um zigoto trisômico. Finalmente, a preservação de fragmentos supranumerários equipados com um telômero em uma extremidade requer ou uma captura de telômeros, por exemplo, um cromossomo marcador supranumerário translocado, como relatado em Vetro et al. (2012) (casos 2 e 3) ou sua captura por outro cromossomo, o receptor, que perde sua porção distal, formando assim uma célula de 46 cromossomos com uma translocação desequilibrada de novo, como descrito aqui. De fato, o caso 6 com a duplicação do mesmo haplótipo materno (Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2) ilustra a ocorrência de um evento cromotripsia (Fig. 1a), como mostra a presença de duas regiões duplicadas não contíguas separadas por ~ 1,3 Mb das quais a intersticial tem uma orientação invertida (Recurso Online 2: Figura S15). Eventos cromotripsia foram observados em vários casos de translocações desequilibradas de novo (Weckselblatt et al. 2015), e a maioria deles foi relatada como sendo de origem paterna e envolvendo mais de dois cromossomos (Marcozzi et al. 2018). Em contraste, a translocação desequilibrada no nosso caso 6 foi de origem materna e mesmo de novo, de acordo com as investigações de FISH das metáfases parentais. Além disso, pelo menos como julgado pelas investigações de alta resolução (1M) aCGH e FISH, ela envolveu apenas dois cromossomos, enquanto um rearranjo mais complexo foi excluído. Portanto, é tentador especular que o zigoto ou o embrião inicial era trissômico para o cromossomo 8 por causa de uma não-disjunção maternal meiótica ou pós-zigótica. A quebra do cromossomo 8 supranumerário foi seguida pela recuperação de apenas duas porções não contíguas, incluindo a telomérica que, quando já cosidas novamente, foram adquiridas pelo receptor 18q (Fig. 1a).

O modelo de formação das translocações desequilibradas de novo, a partir de um zigoto trissômico, também se encaixa no caso 24, embora não pudéssemos realizar nenhuma investigação molecular de suporte. Entretanto, a presença de uma linha celular residual trissômica para o cromossomo 9, juntamente com uma principal com um cariótipo normal e uma terceira com a translocação t(14;9) desequilibrada sugere como, a partir de um zigoto trissômico, várias linhas celulares podem ser formadas, algumas com a perda total do cromossomo supranumerário e outras com a perda de uma parte dele (9p) e sua porção residual (todo o 9q) capturada por outro cromossomo. Este tipo de mosaico de três linhas celulares raramente tem sido documentado (Phillips et al. 1997), mas no diagnóstico pré-natal os mosaicos com uma linha celular normal e uma segunda com uma translocação desequilibrada de novo são relativamente comuns e uma idade materna aumentada pode ser detectada na maioria deles (Kovaleva e Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Um suporte independente para a hipótese de que a não-disjunção materna é o principal gatilho para translocações desbalanceadas de novo, é uma idade materna aumentada. De fato, em nossos oito casos (casos 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28, e 32), onde a duplicação estava sem dúvida ligada a uma não-disjunção meiótica materna (dois alelos maternos diferentes dentro da região de duplicação), foi documentado um aumento da idade média materna (34,75 anos, Recurso Online 1: Tabela S1), levando em conta que a idade média materna na Itália em 2016 era de 31,8 anos (ISTAT, https://www.istat.it/). Um aumento (33,5 anos) também foi reconhecido nos 12 casos (casos 4, 5, 6, 10, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 e 37) com duplicação do mesmo alelo materno, compatível com uma não-disjunção materna como um evento iniciador. Mesmo nos casos em que a duplicação foi paterna, um aumento, embora muito mais limitado, foi mostrado na idade média materna (32,6 anos), possivelmente indicando que outros mecanismos além da não-disjunção materna podem desempenhar um papel na formação dessas translocações desequilibradas. De fato, nos quatro casos (3, 8, 29 e 36) analisados pela matriz do SNP não houve hetero-isodisomia materna na porção não duplicada dos cromossomos homólogos (Recurso Online 1: Tabela S2), como seria de se esperar de um zigoto trissômico no qual o cromossomo paterno supranumerário havia sido submetido à cromotripsia com o resgate apenas da porção telomérica. Assim, levando também em consideração a freqüência desprezível da trissomia originada pela má segregação na meiose paterna (Nagaoka et al. 2012), a ocorrência de translocações desequilibradas, inflamadas pelo resgate trissômico parcial de um zigoto trissômico paterno de origem, parece altamente improvável. Ao invés disso, outros mecanismos, tais como uma quebra paterna hereditária ou pós-zigótica de dupla corda que necessita ser reparada por captura telomérica, parecem mais plausíveis (Fig. 1b). De fato, o caso 25, que é mosaico para duas linhas celulares, presente no sangue e nos fibroblastos, com uma deleção terminal 2q e um cromossomo derivado der(2)t(2q;14q) de origem paterna (Online Resource 2:Figura S9), se enquadra nesta hipótese. Assim, na presença de uma deleção terminal, diferentes mecanismos de reparo podem ocorrer em diferentes momentos em diferentes células do embrião inicial, eventualmente levando a uma condição de mosaico. Neste modelo, o cromossomo deletado inicia o evento de translocação, atuando como receptor, enquanto o duplicado é o doador, operando como reparador de lesão (Fig. 1b). Entretanto, não é possível discernir se a deleção é realmente o primeiro evento que leva à translocação ou se é secundária à formação de um cromossomo dicêntrico (Fig. 1BIII e IV) que, como resultado de sua ruptura assimétrica, gera um inv-dup del cromossomo e um simplesmente deletado, sendo este último, então, reparado por captura telomérica (Fig. 1b). É possível que a persistência do dicêntrico além das primeiras divisões embrionárias resulte em rupturas de tamanhos diferentes nas diferentes células, novamente reparadas por telomerase ou captura de telômeros.

Remarkably, qualquer que seja o mecanismo, uma alta prevalência de casos, onde ambos os desequilíbrios têm a mesma origem parental foi detectada (Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2), apesar de uma origem biparental de deleção e duplicação seria esperada em metade dos casos, de acordo com um evento final pós-zigótico. A demonstração de uma compartimentação distinta dos dois conjuntos de cromossomos parentais em embriões de camundongos até o estágio de 8 células (Du et al. 2017) pode fornecer uma explicação. Como este período coincide com uma instabilidade cromossômica muito alta (McCoy et al. 2017), é tentador especular que um mecanismo como a captura de telômeros, necessária para a estabilização de uma anormalidade estrutural anterior, ocorra no mesmo conjunto cromossômico parental da anomalia original. Em contraste, reajustes posteriores seriam esperados de forma aleatória, envolvendo cromossomas de ambos os pais, o que levaria a um cromossoma translocado desequilibrado de origem biparental, como de fato encontramos em cinco casos (casos 10, 12, 27, 30 e 31; Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2).

Como para rearranjos de classe C, não encontramos nenhuma peculiaridade nos pontos de ruptura de junção que pudesse esclarecer se a sua estabilização por captura do telômero da porção cromossômica oposta à deletada se deve a um mecanismo diferente em comparação com os casos em que a captura do telômero é dependente de outro cromossomo. No entanto, esta análise poderia ser feita apenas em dois casos. A constatação de que em 4 dos 5 casos tanto a deleção quanto a duplicação foram de origem paterna sugere que elas derivam de uma deleção original ou da quebra de um cromossomo dicêntrico.

Translocações e inversões não balanceadas complexas (classes B e D)

É consenso geral que estes rearranjos resultam de um dicêntrico intermediário, após sua quebra assimétrica levando a um inv-dup del e a um cromossomo simplesmente deletado (Fig. 1B.III). A aquisição de uma sequência telomérica estabilizadora pode ocorrer por uma série de modalidades: adição de sequências TTAGGG de novas sequências teloméricas, captura telomérica da porção distal de outro cromossoma (Yu e Graf 2010) ou da porção oposta do mesmo cromossoma (Buysse et al. 2009; Fan e Siu et al. 2001), ou mesmo formação de um cromossoma anelar (Rossi et al. 2008). Os dois casos translocados inv-dup del(8p) que poderíamos genotípica (casos 42 e 44) tiveram origem, como esperado (Giglio et al. 2001), pelo NAHR no MI-Mat-Mat, como demonstrado pela presença de dois alelos maternos e um paterno na região de duplicação 8p (Recurso Online 1: Tabela S2). Esta recombinação anormal recorrente é mediada por duplicações segmentares altamente idênticas localizadas a 8p23 dentro de um cromossomo 8 normal e invertido (Giglio et al. 2001). No zigoto, o cromossomo dicêntrico resultante provavelmente sofrerá diferentes eventos de quebra em diferentes células, levando a uma condição em mosaico com uma linha de células del(8p) e uma segunda com o inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), ou em casos excepcionais até mesmo um terceiro com o inv-dup del(8p) terminando com a região distal de outro cromossomo (Pramparo 2004). Estes mosaicos são mais frequentemente detectados no diagnóstico pré-natal, enquanto que na vida pós-natal uma única linha celular com o inv-dup del(8p), translocada ou não, é o achado mais frequente, pelo menos no sangue. Em nossos três casos translocados (casos 42, 43 e 44), os telômeros foram doados por 6q, 17p e Xq, respectivamente, todos de origem materna, e com o mesmo haplótipo de duplicação dos cromossomos maternos 6, 17 e X, como esperado para um evento de estabilização que ocorreu pós-zigótico. Nos três casos restantes (casos 39, 40 e 45), que, como todos os inv-dup del rearranjos não envolvidos 8p, são não recorrentes, o inv-dup translocado foi de origem paterna com alelos paternais idênticos na região de duplicação, enquanto que a captura telomérica foi proporcionada por um cromossomo derivado paterno em dois casos (casos 39 e 49, Recurso Online 2: Figuras S3, S4) e materna no terceiro caso (caso 45), um feto no qual o cromossomo translocado t(inv-dup5p;3q) estava em mosaico com uma linha celular contendo um inv-dup del(5p) não translocado (Recurso Online 2: Figura S12). Notavelmente, a duplicação 5p é de tamanho diferente nas duas linhas celulares (Recurso Online 1: Tabela S1), de fato mostrando que o cromossomo dicêntrico original presumivelmente está presente no zigoto ou no embrião muito precoce (Fig. 1b), sofreu diferentes quebras nas diferentes células, além do embrião em fase de clivagem.

Aleis idênticos duplicados foram relatados de boa fé em todos os rearranjos inv-dup del 8p, indicando assim uma origem intracromossômica desses rearranjos (Hermetz et al. 2014). Assim, esses rearranjos inv-dup translocados parecem ser o resultado final de um evento mitótico inicial, possivelmente no embrião inicial (Voet 2011), tal como uma quebra de dupla cadeia seguida de emparelhamento intrastrand em locais relativamente próximos de seqüências homólogas invertidas, levando à geração do cromossomo dicêntrico com uma região de cópia normal interposta (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Como já mencionado, o produto recíproco do inv-dup del, ou seja, um cromossoma eliminado, pode ser reparado e estabilizado pela captura da porção distal de um cromossoma não-homólogo, ou o braço oposto do mesmo cromossoma, resultando numa simples translocação ou inversão desequilibrada, respectivamente, como propomos para alguns dos rearranjos listados nas classes A e C (Fig. 1b).

Breakpoint junctions

O sequenciamento da junção de translocação do ponto de quebra poderia ser feito em 26 casos (Recurso Online 1: Tabela S1, Recurso Online 2: Figura S1) embora em 4 casos a complexidade críptica (casos 4, 10, 28, e 51) tenha prejudicado o sequenciamento fino. Características alternativas de junção final não-homológica (alt-NHEJ) ou de replicação induzida por microhomologia (MMBIR), tais como microhomologias e pequenas inserções templates ou não templates, foram detectadas em 16 casos (casos 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 e 52) (Recurso Online 2: Figura S1). Notavelmente, embora nos casos 18 e 40 o rearranjo tenha ocorrido dentro das seqüências de Alu, a presença de 5 bp de inserção de modelos curtos e 4 bp de microhomologia, respectivamente, mostrou que o rearranjo não realizou um mecanismo mediado por NAHR, mas sim um alt-NHEJ ou MMBIR. O NHEJ canônico (c-NHEJ, junções de extremidades rombas) ocorreu em quatro casos (casos 26, 29, 31, e 43). Nos casos 2 e 38, as junções dos pontos de ruptura, estavam à beira de retrotransposição homóloga (Recurso Online 2: Figura S13). Este achado sugere que, em uma minoria de casos, mecanismos de reparo como a captura de telômeros são facilitados por estas seqüências. Embora Robberecht et al. tenham descoberto que a maioria das suas translocações desequilibradas de novo foram mediadas por NAHR entre LINEs, HERVs, ou duplicações segmentares (Robberecht et al. 2013), podemos excluir um evento NAHR pelo menos no caso 2, onde a presença de dois haplótipos maternos duplicados, um translocado para o cromossoma receptor, indica claramente uma não-disjunção mat-MI (Fig. 1, Recurso Online 1: Tabela S2), tornando assim impossível atribuir a translocação a um evento meiótico. De fato, os eventos de retrotransposição mediados pela LINE-1 têm demonstrado ocorrer em células somáticas do embrião humano inicial, em células-tronco embrionárias humanas, e pelo menos em camundongos principalmente em embriogênese (para uma revisão Kazazian e Moran 2017), apoiando que em nossos casos, a formação da translocação também foi um evento pós-zigótico.

Combinados, estas características indicam que os mecanismos de reparação (c-NHEJ e alt-NHEJ) e os mecanismos de reparação replicadora (MMBIR) são responsáveis pela junção do cromossoma doador com o receptor, ou a porção oposta do mesmo cromossoma (Fig. 1).

Relação genótipo-fenótipo-fenótipo

As correlações genótipo-fenótipo-fenótipo em grandes rearranjos desequilibrados, como os relatados em nosso estudo, são em geral bastante grosseiros, os dados que relatamos adicionam alguns detalhes adicionais também neste contexto.

A forte evidência de que algumas translocações desequilibradas têm origem num zigoto com um cromossoma supranumerário que sofre um evento cromotíptico, sugere que a região de duplicação, embora aparentemente composta apenas da região distal do cromossoma cromotípico, pode conter fragmentos de outras porções, como é o caso do nosso caso 6 e como mostrado por Weckselblatt et al. (2015). Nesses casos, se o tamanho dos fragmentos estiver abaixo do detectável pela matriz CGH, o risco é atribuir o fenótipo anormal apenas aos genes que aparecem duplicados ou deletados, enquanto que uma morbidade maior pode ser devida à expressão anormal do gene gerado pela ruptura do DAT (Fukami et al. 2017).

Outras vezes, em translocações desequilibradas originárias do resgate parcial da trissomia, se a cromotripsia ocorrer no cromossomo supranumerário de origem paterna, a hetero/isodisomia materna seguinte para os dois cromossomos restantes pode gerar mais patogenicidade (Niida et al. 2018), seja pela redução para o estado homozigoto de variantes causadoras de doenças presentes na mãe em estado heterozigoto, ou devido à presença de genes impressos que são expressos apenas pelo alelo paterno.

Como consideração final, é tentador especular que a escolha de qual telômero é capturado para a estabilização do cromossomo quebrado, pode não ser aleatória, mas influenciada pela desregulamentação dos DATs originais (Domínios Topologicamente Associados), por sua vez criando um substrato favorável para contatos inter cromossômicos específicos e compartimentação espacial da cromatina 3D (Dekker e Mirny et al. 2016).