PARADIGMES DO PAPEL DAS INTERACÇÕES CD40-CD40L EM DOENÇAS

Transplante. A cirurgia de transplante não teria atingido o grau de sucesso observado nas últimas décadas sem o desenvolvimento de agentes imunossupressores eficientes que minimizem o risco de rejeição do transplante. O anticorpo monoclonal (MAb) contra CD40L tem sido utilizado como tratamento imunossupressor em muitos modelos de transplantes de animais. Nos primatas, a administração de MAb anti-CD40L retarda a rejeição do transplante de aloenxertos, enquanto que a combinação com CTLA4Ig, uma proteína quimérica que consiste no domínio extracelular da molécula de superfície celular CTLA-4 e a região Fc da IgG1 humana que bloqueia a via CD28-B7, tem efeitos aditivos e sinérgicos. Este tratamento combinado sustenta a sobrevivência do aloenxerto renal em primatas e aumenta a sobrevivência do enxerto de pele em camundongos (53, 69). A mudança para a terapia anti-CD40L MAb, após 60 dias de imunossupressão convencional com CsA, foi um tratamento eficaz em um modelo de aloenxerto renal com macacos, mesmo sabendo-se que o CsA diminui a expressão do CD40L nas células T (7). Foi demonstrado que a expressão do gene CD40L aumentou quatro vezes em casos de rejeição aguda. Isto poderia servir como um método não-invasivo para monitorar a função do aloenxerto e também para determinar a resposta biológica a agentes imunossupressores clássicos como CsA e tacrolimus, ambos conhecidos por inibir a indução do CD40L (54). Em modelos de transplante animal, os inibidores de calcineurina suprimem a expressão do CD40L nas células T in vitro, mas não no tecido linfóide, indicando que a via CD40-CD40L permanece funcional durante o tratamento com esses agentes, o que pode contribuir para a rejeição do aloenxerto no ambiente clínico (63).

Aterosclerose. A visão atual da aterosclerose, a doença fatal mais prevalente no mundo ocidental, é a de uma doença crônica, degenerativa, inflamatória, na qual se pensa que o sistema imunológico tem um papel importante. A CD40 e CD40L são superexpressas em lesões ateroscleróticas experimentais e humanas. A ligação CD40 em tipos de células associadas a ateromas, como células endoteliais, células musculares lisas e macrófagos, leva ao aumento da expressão de mediadores para o desenvolvimento de aterosclerose, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e metaloproteinases. O bloqueio das interações CD40-CD40L com o anti-CD40L MAb em camundongos resulta em diminuição da formação e progressão do ateroma de camundongos, mas também promove tais mudanças na biologia e estrutura da lesão, que podem ser importantes na estabilização da placa na doença humana (52).

Platelets também expressam o CD40L e acredita-se que contribuam significativamente para o recrutamento de células inflamatórias para o endotélio danificado in vivo (5). As células T ativadas expressando CD40L estão localizadas dentro da parede do vaso aterosclerótico, um fato que suporta a hipótese de que células T CD4+ ativadas podem orquestrar o processo aterosclerótico (43).

Outras doenças nas quais o par CD40-CD40L pode desempenhar um papel estão resumidamente delineadas na Tabela 1. Uma breve discussão do papel dessa interação nas doenças auto-imunes lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite reumatóide (AR) e polimiosite segue abaixo.

SLE. (i) Expressão do CD40L no LES humano (Tabela 2). Desai-Mehta et al. relataram que células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com lúpus ativo exibem um aumento de 21 vezes na porcentagem de células CD40L+ CD4+ em comparação com indivíduos saudáveis. Na estimulação adicional da PBMC com anti-CD3 MAb, a percentagem de células CD40L+ CD4+ aumentou cinco vezes em indivíduos saudáveis mas apenas 1,4 vezes em pacientes com LES ativos. No entanto, a percentagem de células CD40L+ T ainda permaneceu mais elevada no grupo do LES activo. PBMC de pacientes com LES em remissão comportaram-se de forma semelhante à do grupo controle. Observações semelhantes foram feitas em relação à expressão de CD40L por células T CD8+ recentemente isoladas de pacientes com LES ativo (expressão 22 vezes maior do que a do grupo controle). As células B superexpressas CD40L em pacientes com LES ativos em níveis comparáveis aos observados nas células T ativadas. As células B humanas normais expressam níveis muito baixos de CD40L e somente quando são manipuladas, em contraste com as células B do LES ativo que expressam CD40L espontaneamente (12).

Num estudo publicado por Koshy et al., PBMC ativado de sujeitos saudáveis ou pacientes de controle de doenças mostrou expressão de alta intensidade de CD40L com uma diminuição gradual para valores próximos à linha de base em 48 h, enquanto que o lúpus PBMC continuou a demonstrar níveis significativamente mais altos de CD40L neste momento. Nenhuma correlação aparente da expressão de CD40L com a atividade da doença foi encontrada neste estudo (33).

Higuchi et al. confirmaram esses resultados tanto no LES quanto no lúpus murino, sugerindo que a expressão ectópica de CD40L nas células B do lúpus pode desempenhar um papel crucial no desenvolvimento do LES. Ratos com lúpus transgênico, expressando CD40L em células B, produzem autoanticorpos espontaneamente e, além disso, metade desses ratos desenvolvem glomerulonefrite com deposição de complexo imunológico (22). Devi et al. também confirmaram a alta expressão de CD40L nas células T e B do lúpus. Mais especificamente, 45% das células T de pacientes com LES expressam CD40L em comparação com apenas 8 a 18% das células T de indivíduos saudáveis ou pacientes com AR. Além disso, 30% dos 48 pacientes com LES examinados também tinham aumento da expressão de CD40L nas células B (13). Entretanto, em contraste com os resultados acima, há um relato em que não foram encontradas alterações na expressão de CD40L em linfócitos lupus. Em vez disso, esses autores relataram alta expressão de CD86 em células B de LES, que também é uma importante molécula co-estimuladora (3). Outro estudo relatou que monócitos de pacientes com LES ativo expressam o CD40L de forma aberrante. Vinte e três pacientes com LES ativo foram estudados e comparados com 16 indivíduos saudáveis. Os resultados mostraram um aumento de sete vezes na frequência de monócitos CD40L exprimindo os monócitos periféricos de pacientes com LES em comparação com indivíduos saudáveis. A expressão do CD40L foi verificada nos níveis de mRNA e proteína e correlacionada significativamente com a atividade da doença (28).

CD40L é clivada da superfície celular das células T ativadas, por uma metaloproteinase matriz, liberando sCD40L, uma molécula de aproximadamente 18 a 20 kDa, que forma homotrimers. Um relatório estudando o papel funcional do sCD40L concluiu que o sCD40L pode induzir a ativação e diferenciação das células B. Os níveis de sCD40L plasmáticos foram significativamente mais elevados em pacientes com LES ativos do que em doadores saudáveis. Estes níveis correlacionaram-se com a atividade da doença, avaliada pelo SLEDAI, e com os títulos de autoanticorpos de DNA (dsDNA) circulantes. Foi feita a hipótese de que níveis elevados de sCD40L encontrados em doentes com LES activos podem desempenhar um papel patogénico na vasculite e na nefrite que ocorre no lúpus activo. Os autores propuseram que os níveis de sCD40L poderiam servir no futuro como um marcador preditivo de crises de doença do LES (27). Vakkalanka et al. também mostraram concentrações médias significativamente maiores de sCD40L em pacientes com lúpus do que em controles de doenças e indivíduos saudáveis. Mais especificamente, 66 pacientes com LES foram estudados e comparados com 30 pacientes de controle de doenças e 23 indivíduos saudáveis. Nos indivíduos saudáveis, o sCD40L era quase indetectável, enquanto 38 pacientes com LES tinham um nível de sCD40L acima de 2 ng/ml (com uma concentração média de 2,61 ± 2,15 ng/ml) e apenas 7 pacientes de controle de doença tinham um nível de sCD40L acima de 1 ng/ml. Os pacientes foram divididos em três grupos, severo, moderado e leve, de acordo com as manifestações clínicas. Os pacientes com LES grave tinham uma concentração média de 3,93 ± 2,86 ng/ml de sCD40L, os pacientes com LES moderado tinham uma concentração média de 2,81 ± 1,57 ng/ml e, finalmente, os pacientes com doença leve tinham uma concentração média de 1,52 ± 1.06 ng/ml, indicando uma correlação entre o nível de sCD40L e a atividade da doença (62).

Embora a indução de CD40L em células T normais ativadas seja inibida na presença de CsA, é de interesse que este efeito não se aplique às células T do LES. Um estudo da expressão de CD40L em lúpus humano concluiu que o CsA não inibiu a expressão prolongada e aumentada de CD40L, observada in vitro em células T de lúpus ativadas por MAb anti-CD3. A resistência ao CsA foi independente da atividade da doença. Os monócitos lupus circulantes também apresentam resistência proeminente aos efeitos inibidores do CsA na expressão do CD40L. Estes resultados indicam que a indução de CD40L nas células T do LES pode ser regulada por uma via independente do cálcio/calcineurina (29).

Não está claro porque é que a expressão de CD40L é maior em pacientes com LES e se esta superexpressão tem implicações patogénicas. Foi proposto que os linfócitos T do LES, quando ativados pelo ativamento do TCR, favorecem um perfil dominante do NFAT em vez de um perfil balanceado do fator de transcrição NFAT-AP-1. Este painel de mediadores intracelulares promove a transcrição e estabilidade do mRNA de certos genes, incluindo o gene CD40L. A expressão precoce do CD40L nas células T do LES requer a via NFAT sensível ao CsA, mas a expressão prolongada é mais dependente de uma kinase MAP específica, ou seja, a kinase extracelular regulada pelo sinal. O aumento e a persistência da atividade cinase extracelular regulada pelo sinal nas células T de lúpus poderia contribuir para a superexpressão do CD40L através da ativação do fator de transcrição AP-1 e possivelmente pela estabilização do mRNA CD40L (10, 68). Os fluxos citoplasmáticos Ca2+ são supranormais nas células T e B circulantes de pacientes com LES, e foi proposto que esta anormalidade pode representar o fundo molecular para a expressão anormal do CD40L em lúpus (38, 40, 64). Há também evidências de que a deficiência da cadeia TCR ζ, que tem sido descrita em pacientes com LES, pode ser em parte responsável pela resposta supranormal Ca2+ mencionada acima (39, 61). Essa correlação foi reforçada pelo recente relato de que a correção transfeccional da deficiência da cadeia TCR ζ em células T de lúpus leva à normalização dos fluxos de Ca2+ citoplasmáticos (48).

(ii) Uso de MAb anti-CD40L em modelos de lúpus e no LES. As múltiplas funções do CD40/CD40L na resposta imunológica tornaram-no um alvo atraente para a intervenção terapêutica em doenças auto-imunes. A MAbs contra CD40L foi testada inicialmente em modelos de lúpus murino. O tratamento de ratos F1 Nova Zelândia Preto × Branco Nova Zelândia (NZB×NZW) com infusões contínuas de MAb anti-CD40L resultou num atraso do início da doença durante uma média de 4 meses, uma diminuição dos níveis de anticorpos IgG anti-dsDNA, um atraso na acumulação de células T com o fenótipo de memória activada, uma diminuição do número de células B no baço, e uma supressão da comutação da classe Ig e das mutações somáticas. Os níveis séricos de anticorpos IgG anti-dsDNA foram 4 a 10 vezes mais baixos do que nos controles não tratados de acordo com a idade. Após a interrupção do tratamento, o fenótipo de célula T dos ratos tratados tornou-se indistinguível do dos controles e as células B alcançaram um fenótipo totalmente ativado com elevação dos títulos de antidsDNA IgG e desenvolvimento de proteinúria e doença renal progressiva (65).

Outro estudo empregou tratamento combinado com anticorpos anti-CD40L e CTLA4Ig. O tratamento combinado a curto prazo de ratos pré-nefríticos NZB×NZW F1 resultou em um retardo no início da disfunção renal por aproximadamente 6 meses. Após o início da proteinúria, uma repetição do tratamento foi capaz de induzir a remissão em ratos previamente tratados, mas não em ratos previamente não tratados. Houve uma diminuição no nível de auto-anticorpos IgG anti-dsDNA, e os baços murinos foram marcadamente esgotados de células B, mesmo 16 a 20 semanas após a infusão. Foi postulado que o tratamento CTLA4Ig e anti-CD40L MAb pode agir sinergicamente para bloquear sinais antiapoptóticos e, portanto, facilitar a apoptose das células B durante a ativação precoce das células B. Este tratamento não causou imunossupressão global a longo prazo (66).

Os resultados promissores obtidos em estudos experimentais com animais não foram confirmados no LES. No lúpus humano, a ciclofosfamida continua sendo o “padrão ouro” para o tratamento do envolvimento de órgãos importantes. A ciclofosfamida é um agente alquilante que causa inibição inespecífica da resposta imunológica e imunossupressão clinicamente significativa. Tem efeitos secundários significativos, incluindo cancro da bexiga e falência gonadal, tornando assim necessária a necessidade de novas intervenções terapêuticas. A administração de ciclofosfamida tem sido um tratamento estabelecido para a nefrite do lúpus, uma complicação comum e temível do LES e uma das principais causas de morbidade e mortalidade.

Dois estudos de administração de MAb anti-CD40L em lúpus humano foram publicados. No primeiro, um estudo multicêntrico fase 2, duplo-cego, controlado por placebo, 85 pacientes com LES leve a moderadamente ativo foram inscritos e receberam 6 injeções de IDEC-1 (anti-CD40L MAb) ou placebo ao longo de 16 semanas. A eficácia foi avaliada na semana 20, principalmente através do uso do SLEDAI. Os resultados mostraram que o tratamento com IDEC-1 foi seguro e bem tolerado, mas não demonstrou eficácia em comparação com o placebo (19, 26).

O segundo estudo avaliou pacientes com nefrite lúpus proliferativa comprovada por biópsia usando BG9588 (anti-CD40L MAb). Vinte e oito pacientes com lúpus nefrite proliferativa ativa foram inscritos e receberam 20 mg de BG9588/kg de peso corporal em intervalos quinzenais para as três primeiras doses e em intervalos mensais para quatro doses adicionais. Os resultados mostraram uma redução de 50% na proteinúria (quando presente) sem piora da função renal, desaparecimento da hematúria e aumento da concentração sérica de C3. Os títulos de autoanticorpos anti-dsDNA diminuíram após a terapia, com reduções médias de 38,8, 50,1 e 25,3% em 1, 2 e 3 meses após o tratamento, respectivamente (4). Este estudo foi encerrado prematuramente devido a complicações tromboembólicas. Mais especificamente, dois casos de infarto do miocárdio foram relatados. Os efeitos trombóticos complicando este regime de tratamento levantaram questões importantes em relação a futuros estudos com humanos. Deve-se notar que nenhum dos pacientes que sofreram um evento trombótico tinha anticorpos antifosfolipídicos demonstráveis. O papel da interação CD40-CD40L nestas complicações trombóticas permanece pouco claro e hipotético.

Um estudo de 5 pacientes com lúpus nefrite que receberam terapia anti-CD40L mostrou que um pequeno curso deste tratamento leva a uma redução no número de células B produtoras de anticorpos IgG anti-DNA. Estas alterações persistiram durante vários meses após a interrupção do tratamento (25). Um estudo semelhante em quatro pacientes com nefrite lúpica ativa que receberam tratamento anti-CD40L (BG9588) mostrou que células B expressando CD38, CD5, e CD27, que são consideradas marcadores de diferenciação de células B, desapareceram da periferia durante o tratamento anti-CD40L. Essas alterações foram associadas a uma diminuição dos níveis de anticorpos anti-dsDNA, proteinúria e índice de atividade da doença LES (20).

RA. (i) Expressão do CD40L na AR (Tabela 2). A AR é uma doença reumática sistêmica auto-imune comum caracterizada por um processo destrutivo do tecido crônico atribuído a uma possível resposta imunológica em andamento movida por antígenos. Como se pensa que as células T ativadas desempenham um papel fundamental, não é surpreendente que as interações CD40-CD40L tenham sido estudadas no contexto da AR.

Berner et al. estudaram a expressão da CD40L em células T de pacientes com AR. Sessenta e dois pacientes com AR e 20 sujeitos saudáveis foram estudados. O CD40L foi fortemente expresso em >10% das células T em 29% dos pacientes com AR, mas em 0% das células T nos controles saudáveis. Pacientes de AR com >10% de células T CD4+ CD40L+ tinham doença mais ativa. Oitenta e três por cento dos pacientes deste grupo tinham níveis aumentados de proteína C reativa, 89% tinham fator reumatóide (RF) positivo e nenhum deles preenchia os critérios do American College of Rheumatology para remissão clínica completa, sugerindo uma forte correlação entre a atividade da doença e a expressão de CD40L (2). A expressão de CD40L em níveis elevados pode refletir ativação aumentada e prolongada dos linfócitos, resultando em aumento e prolongamento da atividade inflamatória. A expressão de CD40L funcional em níveis elevados em células T de pacientes com AR também foi demonstrada por MacDonald et al. (42).

Um outro estudo abordou o papel da sinalização de CD40-CD40L na produção de RF. No sistema imunológico saudável, células B autoreativas de alta afinidade são deletadas. Em indivíduos saudáveis, existem células B produtoras de RF de baixa afinidade nos gânglios linfáticos, mas a RF de alta afinidade é indetectável. Na AR, as células B produtoras de RF de alta afinidade acumulam-se dentro da sinóvia inflamada. Os resultados deste estudo indicaram que a interação entre CD40L em células T ativadas com CD40 em células B produtoras de RF é crucial, não apenas para a sobrevivência dessas células B autoreativas, mas também para a síntese de RF. Os dois sinais necessários e suficientes para indução de síntese de RF de alta afinidade in vivo foram encontrados como interação IgG e CD40-CD40L. Na ausência da interação CD40-CD40L, células RF B foram deletadas (35).

Cho et al. estudaram o papel da interação CD40-CD40L na produção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Na AR, a sinóvia inflamada tem características tumorais. A perpetuação e expansão do pannus reumatóide depende da neovascularização, já que a migração extensa de células mononucleares para a sinóvia e o crescimento excessivo do pannus dependem da existência de um leito vascular rico. VEGF, uma glicoproteína dimérica de ligação à heparina, é um mediador central da angiogênese e induz a proliferação de células endoteliais e a permeabilidade capilar. Foi demonstrado que a ligadura CD40 em fibroblastos sinoviais por CD40L em células T ativadas resultou em aumento da produção de VEGF, que é ainda aumentada na presença de IL-1, TNF-α e fator de crescimento transformador β (8). A ligação de CD40 em sinoviócitos RA por CD40L em células T ativadas dentro da sinóvia aumenta significativamente a produção de TNF-α de forma dose-dependente (21). A TNF-α é uma citocina chave na patogênese da AR. Além da TNF-α, a produção de IL-10 também é aumentada através das interações CD40-CD40L (15). As células T do líquido sinovial de pacientes com AR expressam níveis elevados de CD40L em comparação com as células T do sangue periférico de doadores saudáveis e, após a ativação in vitro, exibem uma expressão prolongada e de alto nível de CD40L. Os resultados mostraram que 8,71% das células T de líquido sinovial de pacientes com AR são CD40L+ contra 1,74% no grupo controle (41). O potencial papel da interação CD40-CD40L na patogênese da AR levou a esforços de manipulação farmacológica deste eixo como abordagem terapêutica em pacientes com AR.

(ii) Utilização do anti-CD40L MAb em modelos animais de AR. O tratamento com anti-CD40L MAb suprime o desenvolvimento da artrite induzida por colágeno, que é um modelo animal de AR. Mais especificamente, o desenvolvimento da inflamação articular foi bloqueado, e a infiltração por células inflamatórias do tecido subsinovial e a erosão das cartilagens foram diminuídas (14). Em camundongos transgênicos K/B×N, um modelo de artrite mediada por Ig, o tratamento anti-CD40L MAb diminuiu significativamente o desenvolvimento da artrite quando administrado uma semana antes do início da doença clinicamente aparente, mas o tratamento não teve sucesso quando administrado em doença estabelecida (36).

Dermatomiosite/polimiosite. Em um estudo que analisou 9 pacientes com polimiosite e dermatomiosite, observou-se que as células T filtrantes musculares eram CD40L+ nos 9 casos, sugerindo um potencial papel das interações CD40-CD40L nas entidades clínicas acima (58).