By Elizabeth Burke

Tuesday, August 9, 2016

Naukowcy wykorzystują różne techniki laboratoryjne do badania genetycznych przyczyn ludzkich chorób. W badaniach często wykorzystuje się komórki lub próbki tkanek pacjentów, ale aby ustalić, czy mutacja w konkretnym genie może powodować objawy u pacjenta, często potrzebujemy eksperymentalnych modeli zwierzęcych.

Choć w przeszłości myszy i szczury były powszechnym wyborem do modelowania ludzkich chorób, wykorzystanie zebrafish szybko zyskuje na popularności. Czy to Cię dziwi? Pozwól mi wyjaśnić.

Czym są zebrafish?

Zebrafish to tropikalne słodkowodne ryby z rodziny strzeblowatych. W naturze można je znaleźć w rzekach i stawach Indii, jednak obecnie są często dostępne w sklepach zoologicznych. Nazwa „zebrafish” pochodzi od poziomych niebieskich pasków po każdej stronie ich ciała.

Zebrafish, nazwane tak ze względu na swoje paski, wolą żyć w dużych grupach zwanych ławicami.

Jak można modelować ludzką chorobę u ryb?

Ale chociaż ludzie mogą wydawać się skrajnie różni od zebrafish, w rzeczywistości jesteśmy do nich o wiele bardziej podobni, niż mogłoby się wydawać. W rzeczywistości 70% ludzkich genów znajduje się u ryb zebrafish.

Co więcej, ryby zebrafish mają dwoje oczu, usta, mózg, rdzeń kręgowy, jelito, trzustkę, wątrobę, drogi żółciowe, nerki, przełyk, serce, ucho, nos, mięśnie, krew, kości, chrząstki i zęby. Wiele genów i krytycznych szlaków, które są wymagane do rozwoju tych cech, jest w dużym stopniu zachowanych między ludźmi a zeberkami. Tak więc każdy rodzaj choroby, która powoduje zmiany w tych częściach ciała u ludzi, może być teoretycznie modelowany u zeberek.

Dlaczego warto używać zeberek, skoro można użyć myszy?

Mimo że myszy są ewolucyjnie bardziej podobne do ludzi, ponieważ są ssakami, zebrafki mają kilka zalet w porównaniu ze swoimi futrzastymi konkurentami.

Jedną z ważnych zalet zeberek jest to, że dorosłe osobniki są małe i wolą przebywać w dużych grupach lub „ławicach”. W rezultacie wymagają one znacznie mniej miejsca i są tańsze w utrzymaniu niż myszy.

The NIH Zebrafish Core mieści setki tysięcy zeberek w najnowocześniejszym obiekcie.

Inną zaletą jest to, że dorosłe zebrafisy rozmnażają się łatwo (mniej więcej co 10 dni) i mogą produkować od 50 do 300 jaj na raz. To zupełnie inaczej niż w przypadku myszy, które generalnie mają od jednego do 10 młodych i mogą mieć tylko około trzech miotów w ciągu życia. Eksperymenty naukowe są zazwyczaj powtarzane wielokrotnie w celu udowodnienia, że wyniki są dokładne, więc posiadanie zwierzęcia, które może produkować dużą liczbę potomstwa w kółko jest pomocne.

Eksperymenty zebrafy są również składane i zapładniane zewnętrznie, co pozwala na łatwe manipulowanie nimi na różne sposoby. W razie potrzeby można przeprowadzić zapłodnienie in vitro. Jednokomórkowe zapłodnione jaja mogą być łatwo wstrzykiwane z DNA lub RNA w celu trwałego zmodyfikowania ich genetycznego makijażu, aby wygenerować transgeniczne lub pozbawione mutacji linie zebrafish. Praca z myszami w ten sposób jest znacznie bardziej skomplikowana. Embriony myszy rozwijają się wewnątrz matki i aby uzyskać do nich dostęp i manipulować nimi, matka musiałaby zostać poświęcona. Aby utrzymać embriony przy życiu po ich zapłodnieniu lub wstrzyknięciu, należałoby je również przeszczepić innej samicy myszy.

Larwy ryb, etap rozwoju od trzech do trzydziestu dni po zapłodnieniu, osiągają długość od około 3,5 do 8 milimetrów.

Ponadto, embriony zeberek są przezroczyste, co pozwala naukowcom obserwować pod mikroskopem, jak zapłodnione jaja rozwijają się w pełni ukształtowane ryby. Ich przejrzystość umożliwia również wizualizację tkanek znakowanych fluorescencyjnie w transgenicznych embrionach zebrafish. Embriony myszy nie są przezroczyste i rozwijają się wewnątrz matki, więc obserwacja rozwoju żywych embrionów jak u zebrafish nie jest możliwa.

Jednakże istnieje ograniczenie co do rodzajów chorób, które można badać u zebrafish. Choroby ludzkie wywołane przez geny, które nie występują u zeberek, wymagają innego modelu zwierzęcego. Dodatkowo, zebrafy nie są użytecznymi modelami dla ludzkich chorób, które głównie mają miejsce w typie tkanki lub części ciała, których zebrafy nie posiadają (np. prostata, gruczoły sutkowe, płuca).

Jak dokładnie używasz zebrafy do badania ludzkich chorób?

Często DNA pacjenta jest sekwencjonowane w celu znalezienia mutacji w genie, który potencjalnie może powodować objawy choroby. Aby ustalić, czy utrata funkcji tego genu może powodować objawy obserwowane u pacjenta, ten sam gen jest mutowany lub „wybijany” u zeberek, a następnie ryby są badane pod kątem podobnych objawów. Chociaż jest to znacznie trudniejsze do wykonania, dokładna mutacja, którą ma pacjent, może być wprowadzona do zebry, co nazywa się „knock-in”.

Jeśli jeden lub więcej objawów pacjenta jest obserwowanych w modelu zebry knock-out lub knock-in, zebrafiki mogą być wykorzystywane do dalszych badań, aby pomóc określić, dlaczego mutacja w tym genie powoduje chorobę. Na przykład, struktura włókien mięśniowych może być badana pod mikroskopem w poszukiwaniu nieprawidłowości, jeśli pacjent ma chorobę mięśni. Lub jeśli objawy choroby pacjenta zaczęły się podczas rozwoju in utero, embriony zebrafish knock-out lub knock-in mogą być badane pod kątem zmian w ekspresji genów (w porównaniu do embrionów bez mutacji), które mogą prowadzić do nieprawidłowego rozwoju. W przypadku pacjenta z chorobą neurologiczną, neurony zarodków knock-out mogą być znakowane fluorescencyjnie, aby sprawdzić, czy tworzą się nieprawidłowo.

Oprócz wykorzystania modeli chorób zebrafish do scharakteryzowania chorób ludzkich, naukowcy mogą również zidentyfikować i przetestować nowe leki do leczenia chorób, które są modelowane. Zdolność zeberek do generowania wielu embrionów przy każdym rozmnażaniu czyni je szczególnie użytecznymi w badaniach przesiewowych leków o wysokiej przepustowości.

Jakie są przykłady chorób ludzkich, które zostały z powodzeniem wymodelowane u zeberek?

Okazało się, że generacja znokautowanego genu dystrofiny u zeberek ściśle przypomina ciężkość i postęp ludzkiej choroby – dystrofii mięśniowej Duchenne’a. Stwierdzono, że pacjenci z dystrofią mięśniową Duchenne’a są nosicielami mutacji w dystrofinie i wykazują osłabienie mięśni w dzieciństwie, które stopniowo się pogłębia. Zarówno u ludzi, jak i w modelu zebrafish, utrata dystrofiny stopniowo prowadzi do nekrotycznych włókien mięśniowych, które są zastępowane przez komórki zapalne, zwłóknienia i włókna mięśniowe o nieprawidłowych rozmiarach.

Niniejsza rycina przedstawia wizualne różnice w mięśniach pomiędzy larwą zebrafish typu dzikiego (A, B, C) i larwą dystroficzną (A’, B’, C’). Źródło: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Czerniak u człowieka został również z powodzeniem zamodelowany w zebrafish. Najczęściej identyfikowana mutacja w ludzkich czerniakach – zmiana pojedynczego aminokwasu w genie BRAF – została stworzona w zebrafish w celu stworzenia modelu knock-in. Ponieważ nowotwory są wywoływane przez kombinację kilku zmian genetycznych, ta linia zebr została wykorzystana do zbadania innych potencjalnych mutacji wywołujących raka. Kiedy inna powszechnie obserwowana w czerniaku mutacja genu SETDB1 została dodana do BRAF knock-in zebrafish, czerniak szybko się rozwinął. Wyniki te pomogły ustalić, że SETDB1 jest ważnym genem we wzroście czerniaka.

Te przykłady tego, jak ludzie i zebrafish mogą przejawiać tę samą chorobę pomimo tego, jak różni się wydajemy, sprawiają, że łatwo jest zrozumieć, dlaczego zebrafish stają się dobrze przyjętym modelem zwierzęcym. W NIH Undiagnosed Diseases Program prowadzimy badania z wykorzystaniem zebrafish jako jedno z kilku podejść do badania potencjalnego udziału zmienionych genów w niezwykle rzadkich chorobach naszych pacjentów. Podczas gdy w przeszłości myszy były dominującym zwierzęcym pomostem między gabinetem a łóżkiem pacjenta, ostatnie badania wykazały potencjał zebrafish jako łatwej do zastosowania alternatywy dla myszy. Czas przyjęcia zebrafish jako nowego organizmu modelowego nie mógłby być lepszy, ponieważ badania na myszach często nie przekładają się na ludzi. Chociaż żadne zwierzę nie może doskonale modelować ludzkiej choroby, wierzę, że te małe, pasiaste pływaki mają ogromny potencjał, by w przyszłości przyczynić się do rozwoju badań medycznych.

Aby dowiedzieć się więcej o tym, jak zebrafish przyczyniają się do rozwoju nauk biomedycznych i ludzkiego zdrowia, odwiedź strony internetowe Trans-NIH Zebrafish Initiative oraz NICHD Zebrafish Core.

.