DR. EDWIN B. ASTWOOD był wizjonerem w nowoczesnej endokrynologii. Wspomnienie biograficzne autorstwa Roya Greepa i Monte Greera kończyło się słowami: „Oprócz jego specyficznego wkładu badawczego, dr Edwin B. Astwood odniósł sukces w stopniu osiągniętym przez niewielu w rozpościeraniu szerokiego obszaru pomiędzy naukami przyrodniczymi a medycyną kliniczną.” Dla mnie jest to najwyższe powołanie w endokrynologii.

Późne lata sześćdziesiąte i wczesne lata siedemdziesiąte zostały oznaczone przez niesamowite osiągnięcia dwóch grup, tych z Drs. Andrew Schally i Roger Guillemin, którzy wyizolowali, scharakteryzowali i sekwencjonowali hormony regulacyjne podwzgórza. Pierwszym hormonem regulacyjnym podwzgórza, który został zsekwencjonowany był TRH (tripeptyd), drugim hormon uwalniający gonadotropiny (dekapeptyd), a trzecim somatostatyna o 14 aminokwasach. Istnienie GHRH zostało zasugerowane na początku lat sześćdziesiątych przez klasyczne eksperymenty Reichlina (1); dokonał on zmian w podwzgórzu i wykazał, że zawartość GH w przysadce zmniejszyła się. Na podstawie tych danych, zasugerował, że nie musi być GHRH w hypothalamus.

Zrobiłem moje szkolenie medyczne w Londynie, Anglia, z mojego szkolenia endokrynologicznego pod prof G. Michael Besser. Jedną z najprzyjemniejszych konferencji, w których uczestniczyliśmy regularnie, była prezentacja przypadków klinicznych w Royal Society of Medicine. W mojej pamięci utkwił fakt, że za każdym razem, gdy przedstawiano pacjenta z akromegalią, prof. Peter Sonksen pytał, czy pacjent nie ma dowodów na obecność guza rakowiaka. Postrzeganie na widowni było „Dlaczego ten człowiek zawsze zadaje to pytanie?”, ponieważ takie przypadki prawdopodobnie nie istnieją, a jeśli tak, to bardzo rzadko!

W 1977 roku przeniosłem się z St. Bartholomew’s Hospital (Londyn, Anglia) do University of Virginia. Moim głównym zainteresowaniem w tym czasie były guzy przysadki wydzielające PRL i ich leczenie.

W październiku 1980 roku, 21-letni pacjent został skierowany do mnie przez dr Ann Johanson. Ta pacjentka miała amenorrhea i galactorrhea podczas przyjmowania doustnego środka antykoncepcyjnego w celu zastąpienia steroidów gonadalnych. Miała agenezję gonad z powodu zespołu Turnera.

Jej ocena ujawniła powiększony dół przysadki na zdjęciu rentgenowskim czaszki, masę przysadki z umiarkowanym rozszerzeniem nadsiodłowym na tomografii komputerowej i podwyższony poziom PRL w surowicy 68 μg/L. Jej podwyższony poziom GH w surowicy wynoszący 95 μg/L nie zmniejszył się po podaniu doustnej glukozy, zwiększył się po podaniu TRH i zmniejszył się po podaniu dopaminy. Jej poziom insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF)-I w surowicy był podwyższony do 11 U/mL (norma, 0,41-2,2 U/mL).

Na podstawie tych wyników rozpoznanie akromegalii było jasne. Interesujący jest fakt, że wzrost pacjentki wynosił 5’3″, co jest wartością bardzo wysoką jak na pacjentkę z zespołem Turnera. W związku z tym szczęśliwie udało się zachować surowice z poprzednich 7 lat. Jej stężenie GH w surowicy było podwyższone przez cały ten okres (Tabela 1).

Pacjentka została skierowana na operację przezklinową, którą przeprowadzono 15 stycznia 1981 roku. Siedem tygodni po operacji wykazano, że nadal ma akromegalię; stężenie GH w surowicy wynosiło 52 μg/L, a stężenie IGF-I było nadal podwyższone i wynosiło 7,7 U/mL.

Jako część trwającej współpracy, próbki patologii przysadki zostały wysłane do dr Kalmana Kovacsa (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada). Jakiś czas później dr Kovacs zadzwonił, aby przekazać mi wyniki swojego badania tkanki. Jego raport wskazywał, że pacjent miał hiperplazję somatotropinową, a nie guz przysadki. Powody prowadzące do tej diagnozy były następujące: 1) wzór retikulinowy był zachowany (jest on niszczony w guzach) (ryc. 1); 2) przeważały somatotrofy, chociaż tyreotrofy, gonadotrofy i kortykotrofy były przeplatane; oraz 3) mikroskopia elektronowa somatotrofów ujawniła dobrze rozwinięte retikulum endoplazmatyczne i aparat Golgiego, sugerujące aktywną syntezę hormonów (ryc. 2). Ponieważ somatotrofy były gęsto upakowane z ziarnistości wydzielniczych, to zasugerował mi, że to odzwierciedla hamowanie uwalniania hormonu z powodu sprzężenia zwrotnego wydzielanego GH, przypuszczalnie przez zwiększenie wydzielania somatostatyny (i / lub IGF-I).

Based na histologii przysadki, to było jasne, że przysadka była stymulowana przez czynnik zewnątrzpochodny. Było mało prawdopodobne, że było to spowodowane mutacją w receptorze GHRH lub konstytutywną aktywacją białka G sprzężonego z receptorem GHRH, ponieważ prawdopodobnie wystąpiłoby to w pojedynczej komórce, prowadząc do rozwoju guza i rozpadu wzorca retikulinowego. Dlatego o wiele bardziej prawdopodobne było, że przysadka była stymulowana przez czynnik zewnątrzpochodny, albo GHRH pochodzący z podwzgórza, albo z peryferii. Po drugie, utrzymująca się akromegalia sprawiła, że konieczne stało się znalezienie przyczyny akromegalii u tego pacjenta. W tym czasie w artykule Frohmana i wsp. (2) opisano częściowe oczyszczenie i charakterystykę peptydu o aktywności uwalniającej GH z guzów pozaprzysadkowych pochodzących od pacjentów z akromegalią.

Tomografia komputerowa jamy brzusznej wykazała obecność guza o średnicy 5 cm w ogonie trzustki. W dniu 26 sierpnia 1981 roku guz został usunięty. Był on dobrze zamknięty i w badaniu histologicznym został określony jako guz z komórek wysepek. Jednakże, guz nie był ani guzem z komórek β ani α. Był silnie pozytywny dla enolazy specyficznej dla neuronów, a na immunostaining był negatywny dla GH, insuliny, glukagonu, kalcytoniny i ACTH, z niejednoznacznym barwienia dla somatostatin.

Guz nie zawierał GH przez immunocytochemii. W pierwszych 2 h po usunięciu guza nastąpił szybki spadek poziomu GH w surowicy z 70 μg/L do 3 μg/L (ryc. 3) (3). Pacjentka jest obecnie obserwowana przez 18 lat i pozostaje wyleczona ze swojej akromegalii.

Kolejnym pytaniem było, co zrobić z guzem trzustki. W tym czasie miałem szczęście mieć zmarłego dr Michaela Cronina jako kolegę z Uniwersytetu w Wirginii. Michael przyszedł ze mną na salę operacyjną, aby pomóc we wdrożeniu naszej starannie opracowanej strategii postępowania z guzem. Połowa guza została pokrojona w kostkę i natychmiast umieszczona w ciekłym azocie, a druga połowa została przygotowana do hodowli tkankowej. Ta ostatnia została wysłana do kilku grup, które były ekspertami w tworzeniu stabilnych linii komórkowych. Michael Cronin był w stanie wykazać, że pożywka, w której kąpał się ten guz, zawierała aktywność GHRH i stymulowała cyklazę adenylanową (4). Guz został początkowo dostarczony do dr Wylie Vale w Salk Institute (La Jolla, CA), a on następnie dał część z niego do dr Guillemin. Obie grupy niezależnie stwierdziły, że zawierał on wysoką aktywność GHRH i były w stanie wyizolować GHRH z guza, scharakteryzować go i sekwencjonować (5-8). GHRH z tego guza był 40-aminokwasowym peptydem, który ma homologię z członkami rodziny peptydów glukagonu/sekretyny/VIP.

Wybrałem endokrynologię jako moją specjalność, ponieważ moi mentorzy wywarli na mnie wrażenie znaczenia zastosowania fizjologii do zrozumienia patofizjologii i terapii pacjentów z chorobami endokrynologicznymi.

Każdy pacjent, którego się widzi, jest eksperymentem natury. Miałem wielkie szczęście, że skierowano do mnie tego pacjenta, który umożliwił mi i moim kolegom dostarczenie guza do dwóch wiodących grup, które następnie były w stanie wyizolować, scharakteryzować i sekwencjonować długo poszukiwany GHRH. W rzeczywistości, GHRH był jednym z pierwszych hormonów podwzgórza być poszukiwane, ale nie było wiele false starts.

Było kilka powodów, dlaczego było możliwe w 1982 roku do pomyślnego scharakteryzowania i sekwencjonowania GHRH. Po pierwsze, metody oceny aktywności ekstraktów nowotworowych zostały udoskonalone i były znacznie bardziej czułe. Po drugie, metody mikrosekwencjonowania zostały znacznie ulepszone w ciągu poprzednich 10 lat. Ale trzeci, i prawdopodobnie najważniejszy, powód był taki, że ten guz zawierał wysokie stężenia GHRH i bardzo mało somatostatyny. Somatostatyna hamuje uwalnianie GH w próbie biologicznej, a więc jej obecność utrudniała monitorowanie oczyszczania GHRH. Ekstrakt z tego guza znacznie uprościł proces (ponieważ miał wysokie stężenie GHRH i niewiele somatostatyny było obecne), w porównaniu do wcześniejszych prób przy użyciu setek tysięcy zwierzęcych podwzgórz, które były bogate w somatostatynę i miały bardzo małe stężenia GHRH. Był to pierwszy przykład pojedynczego ludzkiego guza wykorzystanego do identyfikacji i izolacji hormonu. Białko związane z PTH zostało wyizolowane podobną techniką przy użyciu linii komórkowej ludzkiego guza.

Jako klinicyści wszyscy jesteśmy odpowiedzialni za identyfikację eksperymentów natury i wykorzystanie możliwości zadawania pytań, które byłyby bardzo trudne do odpowiedzi w inny sposób. Eksperymenty natury są często unikalne i z pewnością 15 czy 20 pacjentów, którzy pojawili się przed tym jednym, dostarczyło wskazówek, że guz pochodzący od pacjenta z ektopowym wydzielaniem GHRH może odpowiedzieć na pytanie o naturę i strukturę GHRH. W rzeczywistości, grupa Dr Guillemin następnie dowiedziała się o innym guzie od Dr Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Francja), a ponieważ mieli więcej tkanki z tego guza, badali go bardziej agresywnie niż ten z Charlottesville. Jednak to był oryginalny guz Charlottesville, który zasugerował, że taki guz może zaoferować klucz do poszukiwania GHRH.

Późniejsze badania fizjologii GHRH i jego potencjał terapeutyczny jako leczenie niedoboru GH u dzieci był w centrum uwagi naszej grupy pracy w ciągu ostatnich 17 yr (9, 10). Początkowo podawaliśmy GHRH normalnym ochotnikom i wykazaliśmy jego skuteczność i specyficzność w zwiększaniu stężenia GH w surowicy (11). Następnie określiliśmy odpowiedź GH na ostre wstrzyknięcie GHRH u dzieci z idiopatycznym niedoborem GH (ryc. 4). Wiele z tych dzieci miało bardzo silny wzrost GH, podczas gdy u niektórych był mały lub żaden wzrost (12); odpowiedź na GHRH była większa niż na argininę i l-dopę. Na podstawie tych wyników zaproponowaliśmy, że wiele dzieci z idiopatycznym niedoborem GH naprawdę cierpi na niedobór GHRH.

Wieloośrodkowa próba leczenia GHRH została następnie zainicjowana. Wydawało się to szczególnie właściwe, ponieważ GH stosowane w leczeniu niedoboru GH pochodzi z trupów i został zaangażowany w przekazywaniu choroby Jacoba Creutzfelda. W sumie 24 dzieci były leczone; w 10 dzieci pompa była używana do podawania sc GHRH bolus co 3 h. Ta droga i dawka zostały wybrane do naśladowania normalnej fizjologii około jednego impulsu GH co 3 h w rosnących dzieci. Ponadto, 10 dzieci były traktowane z pompy co 3 h tylko w nocy, a 4 dzieci otrzymały dwa razy dziennie sc zastrzyki GHRH. Szybkości wzrostu u dzieci przed i na 6 miesięcy na leczenie są pokazane na ryc. 5 (13).

Na podstawie wyników tego badania, Serono Laboratories, Inc. rozpoczął 12-miesięczne wieloośrodkowe badanie z GHRH(1-29)-NH2 podawany sc raz dziennie (14). Dzieci, które rosły najwolniej, miały największy wzrost szybkości wzrostu (ryc. 6). Sugeruje to, że GHRH może przywrócić fizjologiczne wydzielanie GH. GHRH jest zatwierdzony przez Food and Drug Administration do użytku diagnostycznego, jak również do leczenia niedoboru GH u dzieci. GHRH jest bezpieczny i skutecznie przyspiesza szybkość wzrostu u większości pacjentów z niedoborem GH.

W czasie, gdy GHRH został zsyntetyzowany było duże zainteresowanie w dół-regulacji odpowiedzi gonadotropiny do hormonu uwalniającego gonadotropiny. Zaintrygowała nas obserwacja u innego pacjenta z ektopowym wydzielaniem GHRH z przerzutowego guza rakowiaka, który dał początek akromegalii. Pomimo utrzymującego się podwyższonego poziomu GHRH w ciągu 24-godzinnego okresu, wzór uwalniania GH był nadal pulsacyjny, wskazując, że prawdopodobnie istnieją inne czynniki, które są zaangażowane w regulację pulsacyjnego wzoru wydzielania GH (15). Zasugerowano, że może to być spowodowane wycofaniem somatostatyny. Tak więc, ektopowe wydzielanie GHRH jednoznacznie dowodzi, że długo działający agonista GHRH może zwiększać pulsacyjne wydzielanie GH. Ciągłe badania iv GHRH wlewu u normalnych osób wykazują to samo zjawisko, a zatem jest jasne, że preparat depot GHRH może być użytecznym środkiem terapeutycznym.

Nasza grupa (16) i Mayo (17) sklonował receptor GHRH. Interesujące jest to, że receptor GHRH jest członkiem klasy B receptorów sprzężonych z białkami G, która obejmuje receptory dla rodziny peptydów glukagon/sekretyna, a także CRH, kalcytoninę i hormon przytarczyc. Ich struktura jest zupełnie inna niż większych receptorów rodopsyny (rodzina A). Jednak i w tej rodzinie receptorów występuje siedem domen transmembranowych.

Krytyczną rolę GHRH wykazuje karłowata mysz lit, która ma mutację punktową w receptorze GHRH (18, 19). Wajnrajch i wsp. (20) opisali mutację nonsensowną (Glu 72stop) w ludzkim receptorze GHRH powodującą niewydolność wzrostu i niedobór GH u dwojga dzieci z tej samej indyjskiej rodziny muzułmańskiej. Maheshwari et al. (21) opisali rodzaj w Valley of Sindh w Pakistanie z tą samą mutacją. Członkowie tego rodzaju są ekstremalnie niskiego wzrostu. Inna mutacja w receptorze została opisana w dużym brazylijskim rodzie, który obejmuje ponad 110 osób dotkniętych ciężkim niedoborem GH i ekstremalnie krótką posturą (22). Te eksperymenty natury pokazują, że wada w receptorze GHRH upośledza normalny wzrost i podkreśla istotne znaczenie GHRH.

Karykatura receptora GHRH jest pokazana na ryc. 7 (10). Kwas asparaginowy w pozycji 60 od kodonu startowego jest miejscem mutacji myszy lit. Western blotting przy użyciu C-końcowej surowicy receptora GHRH, która została podniesiona do peptydu opartego na sekwencji ludzkiego receptora GHRH, został wykorzystany do badania błon z komórek HEK293 transfekowanych komplementarnym DNA dla receptora GHRH. Badania wskazują, że receptor myszy litowej jest tłumaczony na białko i jest rzeczywiście obecny w błonie komórek przysadki u myszy litowej. Zaproponowaliśmy, że ta mutacja prowadzi do zmiany w strukturze trzeciorzędowej receptora, co uniemożliwia wiązanie (23). Używając sond o fotopodobieństwie, nasze dowody sugerują, że inne miejsca znajdują się w bliskiej odległości od związanego GHRH, wskazując, że kilka miejsc interakcji jest prawdopodobnie wymaganych do transdukcji sygnału. Dostępność rekombinowanego receptora sprawia, że poszukiwanie niepeptydowych agonistów GHRH jest wykonalne.

W podsumowaniu, wiedza uzyskana z uważnej obserwacji jednego pacjenta z akromegalią doprowadziła do wyizolowania, scharakteryzowania i syntezy GHRH. Dodatkowe badania doprowadziły do wprowadzenia leczenia niedoboru GH za pomocą GHRH. Następnie, my i inni byli w stanie sklonować receptor dla GHRH. Badania z GHRH potwierdziły, że jest on niezbędny do syntezy GH i prawidłowego wzrostu. To stanowisko jest teraz potwierdzone przez obserwacje, że mutacje receptora GHRH, które powodują jego inaktywację, prowadzą do głębokiego niedoboru GH i ciężkiej krótkiej postury i zakończyć koło naszego zrozumienia regulacji GH przez GHRH.