W badaniu opublikowanym przez Koshy i wsp. aktywowane PBMC od osób zdrowych lub pacjentów kontrolujących chorobę wykazywały ekspresję CD40L o wysokiej intensywności ze stopniowym spadkiem do wartości bliskich wartościom wyjściowym w 48 h, podczas gdy PBMC tocznia nadal wykazywały znacznie wyższe poziomy CD40L w tym punkcie czasowym. W tym badaniu nie stwierdzono wyraźnej korelacji ekspresji CD40L z aktywnością choroby (33).

Higuchi i wsp. potwierdzili te wyniki zarówno w SLE, jak i w toczniu u myszy, sugerując, że ektopowa ekspresja CD40L w komórkach B tocznia może odgrywać kluczową rolę w rozwoju SLE. Transgeniczne myszy podatne na toczeń, wykazujące ekspresję CD40L na komórkach B, spontanicznie produkują autoprzeciwciała, a co więcej, u połowy z nich rozwija się kłębuszkowe zapalenie nerek z odkładaniem kompleksów immunologicznych (22). Devi i wsp. potwierdzili również wysoką ekspresję CD40L na komórkach T i B tocznia. Dokładniej, 45% komórek T pochodzących od chorych na SLE wykazuje ekspresję CD40L w porównaniu z zaledwie 8 do 18% komórek T pochodzących od osób zdrowych lub chorych na RZS. Co więcej, 30% z 48 badanych pacjentów z SLE miało zwiększoną ekspresję CD40L również na komórkach B (13). Jednakże, w przeciwieństwie do powyższych wyników, istnieje jedno doniesienie, w którym nie stwierdzono zmian w ekspresji CD40L w limfocytach chorych na toczeń. Zamiast tego autorzy ci donieśli o wysokiej ekspresji CD86 na komórkach B SLE, która jest również ważną cząsteczką kostymulującą (3). Inne badanie wykazało, że monocyty pochodzące od pacjentów z aktywnym SLE wykazują ekspresję CD40L w sposób nieprawidłowy. Przebadano 23 pacjentów z aktywnym SLE i porównano ich z 16 zdrowymi osobami. Wyniki wykazały siedmiokrotny wzrost częstości występowania monocytów obwodowych wykazujących ekspresję CD40L pochodzących od chorych na SLE w porównaniu z osobami zdrowymi. Ekspresję CD40L weryfikowano zarówno na poziomie mRNA, jak i białka i korelowała ona istotnie z aktywnością choroby (28).

CD40L jest rozszczepiany z powierzchni komórkowej aktywowanych limfocytów T przez metaloproteinazę macierzy, uwalniając sCD40L, cząsteczkę o masie około 18 do 20 kDa, która tworzy homotrimery. W jednym z raportów badających funkcjonalną rolę sCD40L stwierdzono, że sCD40L może indukować aktywację i różnicowanie komórek B. Stężenie sCD40L w osoczu było istotnie wyższe u pacjentów z aktywną postacią SLE niż u zdrowych dawców. Poziomy te korelowały z aktywnością choroby, ocenianą za pomocą SLEDAI, i krążącymi mianami autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (dsDNA). Postawiono hipotezę, że wysoki poziom sCD40L u chorych z aktywnym toczniem może odgrywać rolę patogenetyczną w zapaleniu naczyń oraz w zapaleniu nerek występującym w aktywnym toczniu. Autorzy zaproponowali, aby poziom sCD40L mógł w przyszłości służyć jako marker predykcyjny zaostrzeń choroby SLE (27). Vakkalanka i wsp. wykazali również istotnie wyższe średnie stężenia sCD40L u chorych na toczeń niż w grupie kontrolnej i u osób zdrowych. W badaniu wzięło udział 66 pacjentów z SLE, których porównano z 30 osobami z grupy kontrolnej i 23 osobami zdrowymi. U osób zdrowych stężenie sCD40L było prawie niewykrywalne, podczas gdy 38 pacjentów z SLE miało stężenie sCD40L powyżej 2 ng/ml (przy średnim stężeniu 2,61 ± 2,15 ng/ml), a tylko 7 pacjentów z grupy kontrolnej choroby miało stężenie sCD40l powyżej 1 ng/ml. Pacjentów podzielono na trzy grupy, ciężką, umiarkowaną i łagodną, w zależności od objawów klinicznych. U pacjentów z ciężkim SLE średnie stężenie sCD40L wynosiło 3,93 ± 2,86 ng/ml, u pacjentów z umiarkowanym SLE średnie stężenie sCD40L wynosiło 2,81 ± 1,57 ng/ml, a u pacjentów z łagodnym przebiegiem choroby średnie stężenie sCD40L wynosiło 1,52 ± 1.06 ng/ml, co wskazuje na korelację między poziomem sCD40L a aktywnością choroby (62).

Podczas gdy indukcja CD40L na aktywowanych prawidłowych komórkach T jest hamowana w obecności CsA, interesujące jest, że efekt ten nie dotyczy komórek T w SLE. W badaniu ekspresji CD40L w toczniu ludzkim stwierdzono, że CsA nie udało się zahamować przedłużonej i zwiększonej ekspresji CD40L, obserwowanej in vitro na aktywowanych anty-CD3 MAb limfocytach T w toczniu. Oporność na CsA była niezależna od aktywności choroby. Krążące monocyty tocznia również wykazują wyraźną oporność na hamujący wpływ CsA na ekspresję CD40L. Wyniki te wskazują, że indukcja CD40L na komórkach T SLE może być regulowana przez ścieżkę niezależną od wapnia/kalcyneuryny (29).

Nie jest jasne, dlaczego ekspresja CD40L jest wyższa u pacjentów z SLE i czy ta nadekspresja ma implikacje patogenetyczne. Zaproponowano, że limfocyty T SLE, kiedy są aktywowane przez TCR, faworyzują profil NFAT-dominujący zamiast zrównoważonego profilu NFAT-AP-1 czynnika transkrypcyjnego. Ten panel wewnątrzkomórkowych mediatorów promuje transkrypcję i stabilność mRNA pewnych genów, w tym genu CD40L. Wczesna ekspresja CD40L na komórkach T SLE wymaga wrażliwego na CsA szlaku NFAT, ale przedłużona ekspresja jest bardziej zależna od specyficznej kinazy MAP, tj. kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym. Zwiększona i utrzymująca się aktywność kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym w komórkach T tocznia może przyczyniać się do nadekspresji CD40L poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego AP-1 i prawdopodobnie poprzez stabilizację mRNA CD40L (10, 68). Cytoplazmatyczne przepływy Ca2+ są ponadnormalne w krążących komórkach T i B od pacjentów z SLE, i zaproponowano, że ta nieprawidłowość może stanowić molekularne tło dla nieprawidłowej ekspresji CD40L w toczniu (38, 40, 64). Istnieją również dowody, że niedobór łańcucha TCR ζ, który został opisany u chorych na SLE, może być częściowo odpowiedzialny za wspomnianą powyżej ponadnormalną odpowiedź Ca2+ (39, 61). Korelacja ta została wzmocniona przez ostatnie doniesienie, że transfekcyjna korekta niedoboru łańcucha TCR ζ w komórkach T tocznia prowadzi do normalizacji cytoplazmatycznych strumieni Ca2+ (48).

(ii) Zastosowanie anty-CD40L MAb w modelach tocznia i w SLE. Wielorakie funkcje CD40/CD40L w odpowiedzi immunologicznej uczyniły z niego atrakcyjny cel interwencji terapeutycznej w chorobach autoimmunologicznych. MAbs przeciwko CD40L były początkowo testowane w modelach tocznia u myszy. Leczenie myszy F1 New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) ciągłymi wlewami MAb anty-CD40L spowodowało opóźnienie początku choroby o średnio 4 miesiące, spadek poziomu autoprzeciwciał IgG anty-dsDNA, opóźnienie akumulacji komórek T o fenotypie aktywowanej pamięci, spadek liczby komórek B w śledzionie oraz zahamowanie przełączania klas Ig i mutacji somatycznych. Poziomy przeciwciał IgG anty-dsDNA w surowicy były od 4 do 10 razy niższe niż u nieleczonych, dopasowanych wiekowo osób kontrolnych. Po zaprzestaniu leczenia fenotyp komórek T leczonych myszy stał się nie do odróżnienia od fenotypu myszy kontrolnych, a komórki B osiągnęły w pełni aktywowany fenotyp z podwyższeniem miana IgG anty-dsDNA oraz rozwojem białkomoczu i postępującą chorobą nerek (65).

W innym badaniu zastosowano leczenie skojarzone przeciwciałem anty-CD40L i CTLA4Ig. Krótkotrwałe leczenie skojarzone myszy NZB×NZW F1 z prenefrytycznym zapaleniem nerek spowodowało opóźniony początek dysfunkcji nerek o około 6 miesięcy. Po wystąpieniu białkomoczu, powtórny kurs leczenia był w stanie wywołać remisję u wcześniej leczonych myszy, ale nie u wcześniej nieleczonych. Stwierdzono zmniejszenie poziomu autoprzeciwciał IgG anty-dsDNA, a śledziony myszy były wyraźnie pozbawione komórek B, nawet 16 do 20 tygodni po infuzji. Postulowano, że leczenie CTLA4Ig i anty-CD40L MAb może działać synergistycznie w celu zablokowania sygnałów antyapoptotycznych, a tym samym ułatwienia apoptozy komórek B podczas wczesnej aktywacji komórek B. Leczenie to nie powodowało długotrwałej globalnej immunosupresji (66).

Obiecujące wyniki uzyskane w badaniach eksperymentalnych na zwierzętach nie zostały potwierdzone w SLE. W toczniu u ludzi cyklofosfamid pozostaje „złotym standardem” w leczeniu zajęcia głównych narządów. Cyklofosfamid jest środkiem alkilującym, który powoduje nieswoiste zahamowanie odpowiedzi immunologicznej i klinicznie istotną immunosupresję. Ma on znaczące działania niepożądane, w tym raka pęcherza moczowego i niewydolność gonad, co powoduje konieczność poszukiwania nowych interwencji terapeutycznych. Podawanie cyklofosfamidu jest uznanym sposobem leczenia toczniowego zapalenia nerek, częstego i budzącego lęk powikłania SLE oraz jednej z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności.

Opublikowano wyniki dwóch badań dotyczących podawania MAb anty-CD40L w toczniu u ludzi. W pierwszym z nich, wieloośrodkowym badaniu fazy 2, prowadzonym metodą podwójnie ślepej próby, kontrolowanym placebo, wzięło udział 85 pacjentów z łagodnym do umiarkowanie aktywnego SLE, którzy otrzymywali 6 wstrzyknięć IDEC-1 (anty-CD40L MAb) lub placebo w ciągu 16 tygodni. Skuteczność oceniano w 20. tygodniu, głównie za pomocą SLEDAI. Wyniki wykazały, że leczenie IDEC-1 było bezpieczne i dobrze tolerowane, ale nie wykazało skuteczności w porównaniu z placebo (19, 26).

W drugim badaniu oceniano pacjentów z potwierdzonym biopsją proliferacyjnym toczniowym zapaleniem nerek, stosując BG9588 (anty-CD40L MAb). Do badania włączono 28 pacjentów z aktywnym proliferacyjnym toczniowym zapaleniem nerek, którzy otrzymywali 20 mg BG9588/kg masy ciała w odstępach dwutygodniowych przez pierwsze trzy dawki i w odstępach miesięcznych przez cztery dodatkowe dawki. Wyniki wykazały 50% zmniejszenie białkomoczu (jeśli występował) bez pogorszenia czynności nerek, ustąpienie krwiomoczu i zwiększenie stężenia C3 w surowicy. Miano autoprzeciwciał anty-dsDNA zmniejszyło się po leczeniu, ze średnim zmniejszeniem o 38,8, 50,1 i 25,3% odpowiednio po 1, 2 i 3 miesiącach od rozpoczęcia leczenia (4). Badanie to zostało zakończone przedwcześnie z powodu powikłań zakrzepowo-zatorowych. Dokładniej, odnotowano dwa przypadki zawału mięśnia sercowego. Efekty zakrzepowe komplikujące ten schemat leczenia podniosły istotne kwestie dotyczące przyszłych badań z udziałem ludzi. Należy zauważyć, że żaden z pacjentów, u których wystąpiło zdarzenie zakrzepowe, nie miał wyraźnych przeciwciał antyfosfolipidowych. Rola interakcji CD40-CD40L w tych powikłaniach zakrzepowych pozostaje niejasna i hipotetyczna.

Badanie 5 pacjentów z toczniowym zapaleniem nerek, u których zastosowano terapię anty-CD40L wykazało, że krótki kurs tego leczenia prowadzi do zmniejszenia liczby komórek B produkujących przeciwciała IgG anty-DNA. Zmiany te utrzymywały się przez kilka miesięcy po zaprzestaniu leczenia (25). Podobne badanie czterech pacjentów z aktywnym toczniowym zapaleniem nerek, którzy otrzymywali leczenie anty-CD40L (BG9588), wykazało, że komórki B wykazujące ekspresję CD38, CD5 i CD27, które są uważane za markery różnicowania komórek B, zniknęły z obwodu podczas leczenia anty-CD40L. Zmiany te były związane ze zmniejszeniem stężenia przeciwciał anty-dsDNA, białkomoczu i wskaźnika aktywności choroby SLE (20).

RA. (i) Ekspresja CD40L w RZS (tabela 2). RZS jest częstą autoimmunologiczną układową chorobą reumatyczną charakteryzującą się przewlekłym procesem destrukcji tkanek, przypisywanym prawdopodobnie trwającej odpowiedzi immunologicznej napędzanej przez antygen. Ponieważ uważa się, że aktywowane komórki T odgrywają kluczową rolę, nie jest zaskakujące, że interakcje CD40-CD40L były badane w kontekście RZS.

Berner i wsp. badali ekspresję CD40L na komórkach T od pacjentów z RZS. Przebadano 62 pacjentów z RZS i 20 zdrowych osób. CD40L ulegał silnej ekspresji na >10% komórek T u 29% chorych na RZS, ale na 0% komórek T u zdrowych osób z grupy kontrolnej. Chorzy na RZS z >10% komórek T CD4+ CD40L+ mieli bardziej aktywną chorobę. Osiemdziesiąt trzy procent pacjentów w tej grupie miało podwyższony poziom białka C-reaktywnego, 89% miało dodatni czynnik reumatoidalny (RF), a żaden z nich nie spełniał kryteriów American College of Rheumatology dla całkowitej remisji klinicznej, co sugeruje silną korelację pomiędzy aktywnością choroby a ekspresją CD40L (2). Ekspresja CD40L na wysokim poziomie może odzwierciedlać zwiększoną i przedłużoną aktywację limfocytów, co skutkuje zwiększoną i przedłużoną aktywnością zapalną. Ekspresję funkcjonalnego CD40L na wysokim poziomie na komórkach T pochodzących od pacjentów z RZS wykazali również MacDonald i wsp. (42).

Inne badanie dotyczyło roli sygnalizacji CD40-CD40L w produkcji RF. W zdrowym układzie odpornościowym, autoreaktywne komórki B o wysokim powinowactwie są usuwane. U zdrowych osób, komórki B produkujące RF o niskim powinowactwie istnieją w węzłach chłonnych, ale RF o wysokim powinowactwie jest niewykrywalny. W RZS komórki B wytwarzające RF o wysokim powinowactwie gromadzą się w obrębie zapalnej błony maziowej. Wyniki tego badania wskazują, że interakcja pomiędzy CD40L na aktywowanych limfocytach T a CD40 na komórkach B produkujących RF jest kluczowa, nie tylko dla przetrwania tych autoreaktywnych komórek B, ale także dla syntezy RF. Stwierdzono, że dwoma sygnałami niezbędnymi i wystarczającymi do indukcji syntezy RF o wysokim powinowactwie in vivo są interakcja IgG i CD40-CD40L. W przypadku braku interakcji CD40-CD40L, komórki B RF zostały usunięte (35).

Cho i wsp. badali rolę interakcji CD40-CD40L w produkcji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). W RZS zapalna błona maziowa ma cechy nowotworu. Utrwalenie i rozrost pannusa reumatoidalnego zależy od neowaskularyzacji, ponieważ rozległa migracja komórek jednojądrzastych do błony maziowej i rozrost pannusa zależą od istnienia bogatego łożyska naczyniowego. VEGF, dimeryczna glikoproteina wiążąca heparynę, jest głównym mediatorem angiogenezy, indukuje proliferację komórek śródbłonka i przepuszczalność naczyń włosowatych. Wykazano, że ligacja CD40 na fibroblastach maziowych przez CD40L na aktywowanych limfocytach T powoduje zwiększoną produkcję VEGF, która ulega dalszemu nasileniu w obecności IL-1, TNF-α i transformującego czynnika wzrostu β (8). Ligacja CD40 na synowiocytach RZS przez CD40L na aktywowanych limfocytach T w obrębie błony maziowej znacząco zwiększa produkcję TNF-α w sposób zależny od dawki (21). TNF-α jest kluczową cytokiną w patogenezie RZS. Poza TNF-α, produkcja IL-10 jest również zwiększana poprzez interakcje CD40-CD40L (15). Komórki T z płynu maziowego pochodzące od chorych na RZS wykazują wysoką ekspresję CD40L w porównaniu z komórkami T z krwi obwodowej zdrowych dawców, a po aktywacji in vitro wykazują przedłużoną, wysoką ekspresję CD40L. Wyniki wykazały, że 8,71% komórek T pochodzących z płynu maziowego pacjentów z RZS było CD40L+ w porównaniu z 1,74% w grupie kontrolnej (41). Potencjalna rola interakcji CD40-CD40L w patogenezie RZS doprowadziła do podjęcia starań o farmakologiczną manipulację tą osią jako podejście terapeutyczne u pacjentów z RZS.

(ii) Zastosowanie anty-CD40L MAb w zwierzęcych modelach RZS. Leczenie za pomocą anty-CD40L MAb hamuje rozwój zapalenia stawów indukowanego kolagenem, które jest zwierzęcym modelem RZS. Dokładniej, rozwój zapalenia stawów został zablokowany, a infiltracja przez komórki zapalne tkanki podsynowej i erozja chrząstki uległy zmniejszeniu (14). U myszy transgenicznych K/B×N, modelu Ig-mediowanego zapalenia stawów, leczenie MAb anty-CD40L znacząco zmniejszyło rozwój zapalenia stawów, gdy podawano je tydzień przed wystąpieniem klinicznie widocznej choroby, ale leczenie było nieskuteczne, gdy podawano je w ustalonej chorobie (36).

Zapalenie skórno-mięśniowe/zapalenie wielomięśniowe. W jednym z badań analizujących 9 pacjentów z zapaleniem wielomięśniowym i skórno-mięśniowym zaobserwowano, że komórki T naciekające mięśnie były CD40L+ we wszystkich 9 przypadkach, co sugeruje potencjalną rolę interakcji CD40-CD40L w powyższych jednostkach klinicznych (58).

Dermatomyositis/polymyositis.