Abstract

Chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV) is a severe illness with unusual EBV activation that persists for years, a jej patogeneza jest w dużej mierze nieznana. Po stworzeniu dokładnego i powtarzalnego systemu łańcuchowej reakcji polimerazy do ilościowego oznaczania DNA EBV, ładunki wirusa w limfocytach krwi obwodowej (PBL) zostały określone u 54 dzieci: 15 z CAEBV, 16 z mononukleozą zakaźną (IM) i 23 zdrowych dzieci. Dzieci z CAEBV oraz dzieci z IM miały wysokie ładunki wirusa. Niższe ładunki wykryto u 47% seropozytywnych zdrowych dawców. Istniały dwie wyraźne różnice pomiędzy dziećmi z CAEBV i tymi z IM: Te pierwsze miały większą replikację wirusa (103-107 kopii/PBL)2,5 × 105 PBL) niż te z IM, a także replikacja wirusa zmniejszała się u dzieci z IM, podczas gdy aktywna replikacja utrzymywała się przez lata u osób z CAEBV. Utrzymujące się wysokie ładunki wirusa są możliwym kryterium diagnostycznym dla CAEBV. Obciążenia EBV mogą umożliwić klasyfikację i rokowanie w zakażeniach EBV.

Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest czynnikiem sprawczym mononukleozy zakaźnej (IM) i przewlekłego aktywnego zakażenia EBV (CAEBV). CAEBV jest ciężką chorobą z nietypową aktywacją EBV, która może być śmiertelna z niewydolnością wielonarządową, i jest związana z chłoniakiem złośliwym bez wcześniejszej immunosupresji. Kliniczne objawy CAEBV i serologiczne nieprawidłowości odpowiadające aktywnej replikacji EBV, takie jak znacznie podwyższone przeciwciała anty-EA-DR i brak przeciwciał przeciwko antygenowi jądrowemu Epsteina-Barr (EBNA), utrzymują się przez miesiące do lat. EBV replikuje się w komórkach NK, T i B.

Po ustaleniu się zakażenia, EBV zwykle pozostaje w limfocytach B przez całe życie gospodarza, nie powodując żadnych objawów klinicznych (określanych jako zakażenie utajone). Dlatego nie tylko wykrywanie, ale także ilościowe oznaczanie EBV w dotkniętych tkankach jest niezbędne do badania choroby EBV.

Aby wyjaśnić status replikacji EBV u osób z CAEBV, użyliśmy półilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy DNA (PCR) do oceny i porównania ładunków wirusa w limfocytach krwi obwodowej (PBL) w 3 grupach dzieci: jednej z CAEBV, jednej z IM, i zdrowych kontrolach. Nasz system detekcji został uznany za dokładny i wiarygodny do ilościowego oznaczania EBV, ponieważ amplifikowaliśmy region o pojedynczej kopii EBV. Większość poprzednich badań ukierunkowana była na region BamHI-W, dla którego częstotliwość powtórzeń tandemowych jest niestabilna. Uważamy, że to badanie jest pierwszym i największym badaniem obciążenia wirusem w PBL dzieci z CAEBV.

Materiały i Metody

Pacjenci i kontrole

Badaliśmy 16 dzieci z IM (11 chłopców, 5 dziewczynek; wiek, 0-8 lat), 15 z CAEBV (11 chłopców, 4 dziewczynki; wiek, 4-19 lat), 19 immunokompetentnych EBV-seropozytywnych zdrowych osób (10 chłopców, 9 dziewczynek; wiek, 1-19 lat), i 4 seronegatywne zdrowe dzieci (3 chłopców, 1 dziewczynka; wiek, 1-10 lat). U wszystkich osób z IM występowały typowe objawy kliniczne (np. gorączka, zapalenie migdałków podniebiennych, powiększenie węzłów chłonnych, hepatosplenomegalia, zaburzenia czynności wątroby i atypowa limfocytoza). Diagnoza IM została postawiona na podstawie wyników serologicznych przeciwciał IgM przeciwko antygenowi kapsydu wirusa (VCA) lub serokonwersji VCA IgG i/lub EA oraz ujemnych przeciwciał EBNA. Dwadzieścia dwie próbki krwi pobrano od 16 dzieci z IM od 8 dni do 8 miesięcy od początku choroby (u wszystkich pacjentów początkowym objawem była gorączka). CAEBV został zdiagnozowany według kryteriów Rickinsona. Dzieci z CAEBV miały przerywaną lub uporczywą gorączkę przez >16 miesięcy, z hepatosplenomegalią, limfadenopatią, i/lub wysypką skórną. Wyniki badań laboratoryjnych wykazały podwyższony poziom transaminaz, niedokrwistość, trombocytopenię i/lub hipergammaglobulinemię poliklonalną. Badania serologiczne wykazały znaczne podwyższenie miana przeciwciał przeciwko VCA i EA. Wykluczono zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności oraz choroby reumatyczne. Żaden z badanych nie przeszedł transplantacji ani nie był poddany terapii przeciwnowotworowej.

Próbki

Pobierano heparynizowane 2-mL próbki krwi obwodowej. PBL izolowano przez ficoll-hypaque i lizowano za pomocą 0,15 μg/μL proteinazy K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA ekstrahowano za pomocą wytrącania fenolu-chloroformu-etanolu. Wyekstrahowane DNA oznaczano ilościowo za pomocą spektrofotometru, dostosowywano do 0,25 μg/μL DNA i używano jako szablonów PCR.

Czułość PCR

EBV DNA pochodziły z trzech źródeł: Raji, zawierającego 50 kopii EBV na komórkę ; Akata, zawierającego 20 kopii na komórkę; oraz sklonowanych fragmentów BamHI-L, które zmieszano z DNA z komórek krwi pępowinowej i użyto jako pozytywnego standardu. Aby określić czułość systemu PCR, seryjne 10-krotne rozcieńczenia (10°-104 kopii EBV) wyekstrahowanego DNA poddano PCR.

PCR

Zagnieżdżony podwójny PCR został zaprojektowany do amplifikacji konserwatywnego regionu kodującego gp220 (w obrębie fragmentu BamHI-L) . Zewnętrzna para primerów amplifikuje fragment 302-bp, stosując oligonukleotydy 5′-GCGAACTGGTGACATGA i 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, odpowiadające pozycjom 2870-3171 B95-8 (GenBank M10593). Wewnętrzna para amplifikuje fragment o długości 239-bp. PCR przeprowadzono w 50-μL reakcji zawierającej 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM każdego primera, 2,5 U polimerazy Taq DNA (Boehringer-Mannheim) i 4 μL przykładowego DNA. Produkty amplifikacji nanoszono na 2% agarozę i barwiono bromkiem etydyny, a w celu potwierdzenia specyficzności stosowano Southern blotting, używając fragmentu BamHI-L jako sondy. Każda reakcja PCR została przeprowadzona w trzech powtórzeniach i obejmowała kontrolę negatywną, aby wykluczyć zanieczyszczenie krzyżowe. Aby potwierdzić specyficzność PCR, analizowano DNA z wirusów herpes simplex typu 1 i 2, wirusa varicella-zoster, ludzkiego wirusa cytomegalii oraz ludzkich herpeswirusów-6 i -7. Nie odnotowano specyficznej amplifikacji.

Kwantyfikacja genomu EBV

Ilość DNA EBV w PBL była określana przez eksperymenty rozcieńczeń ograniczających. Seryjne 10-krotne rozcieńczenia (1-10-6μg) genomowego DNA wyekstrahowanego z każdej próbki DNA poddawano zagnieżdżonemu PCR, jak opisano powyżej, a minimalną granicę dla wyniku dodatniego przeliczano na ładunek wirusa (kopie/2,5 × 105 komórek).

Wyniki

Czułość systemu PCR została dokładnie określona przez 10-krotne rozcieńczenia trzech źródeł DNA EBV: Raji i Akata, obu zawierających stałą liczbę kopii DNA EBV na komórkę, oraz sklonowanego fragmentu BamHI-L. Raji zawiera 50 kopii genomu EBV na komórkę, a 1 μg genomowego DNA z komórek Raji jest równy DNA wyekstrahowanemu z 2,5 × 105 komórek: stąd 1,25 × 107 kopii DNA EBV. DNA z Raji zostało odpowiednio rozcieńczone, a DNA zawierające 10n kopii (seryjne rozcieńczenia 10°-104 kopii wirusa) zostało poddane amplifikacji. Zbadano minimalną granicę dla pozytywnego wyniku PCR. Wielokrotne badania wykazały, że czułość wynosiła 100 kopii na reakcję z odtwarzalnością. Wyniki były takie same przy użyciu DNA Akata i przy eksperymencie rozcieńczeniowym z użyciem 10n kopii fragmentów BamHI-L zmieszanych z 105μg, 102μg i bez DNA komórek krwi pępowinowej.

Wszystkie PBL od osób z IM i CAEBV były pozytywne dla genomu EBV. Dziewięć (47%) z 19 próbek od osób zdrowych EBV-seropozytywnych było pozytywnych. Wszystkie PBL od osób seronegatywnych były negatywne.

EBV DNA w PBL był kwantyfikowany i porównywany dla EBV-seropozytywnych zdrowych kontroli, dzieci z IM, i dzieci z CAEBV (rysunek 1). U zdrowych dzieci EBV-seropozytywnych ładunki wirusa wynosiły 100-1000 kopii na 2,5 × 105 PBL. W PBL od dzieci z IM, najniższe wartości graniczne dla dodatnich wyników PCR wynosiły od 10° μg (2,5 × 105 PBL) do 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) genomowego DNA, wskazując, że ładunek wirusa wynosił 100-100,000 kopii/2,5 × 105 PBL. Trzy próbki krwi pobrane w ciągu miesiąca od początku choroby zawierały wyższe ładunki (1000-100 000 kopii/2,5 × 105 PBL). PBL pobrane >11 miesięcy po wystąpieniu IM zawierały zmniejszoną ilość wirusa. Obserwowaliśmy ładunki wirusa u 4 pacjentów z IM (ryc. 2A). U wszystkich 4, ładunki wirusa zmniejszyły się podczas przebiegu klinicznego, ale były wyższe (100-10,000 kopii/2.5 × 105 PBL) niż u seropozytywnych zdrowych gospodarzy.

PBL od dzieci z CAEBV miały więcej EBV DNA niż próbki od dzieci z IM. Czterech pacjentów z CAEBV było obserwowanych przez >16 miesięcy (rysunek 2B ilustruje wyniki dla 2 pacjentów). Dwóch innych pacjentów miało niezmienione ładunki wirusa przez 2-3 lata (odpowiednio 105 i 106 kopii/2,5 × 105 PBL). Wszyscy ci pacjenci mieli utrzymujące się wysokie ładunki wirusa, w przeciwieństwie do wyników z IM. Badając związek między objawami klinicznymi a obciążeniem EBV, stwierdzono, że tylko gorączka korelowała z obciążeniem wirusem. Nie było korelacji z hepatosplenomegalią, limfadenopatią, egzanthema, alergią na komary, dysfunkcją wątroby, niedokrwistością, trombocytopenią lub mianami przeciwciał w surowicy przeciwko VCA, EA-DR i EBNA.

Dyskusja

PCR kwantyfikujący EBV DNA wykazał, że PBL od dzieci z CAEBV lub IM miał wysokie ładunki wirusa, wskazujące na aktywną replikację EBV w limfocytach. Replikacja wirusowa była uważana za bardziej aktywną w CAEBV niż w IM; w grupie IM replikacja stopniowo zmniejszała się, podczas gdy aktywna replikacja utrzymywała się przez lata u pacjentów z CAEBV.

Nasz system PCR amplifikuje specyficzne dla EBV sekwencje kodujące gp220, który jest genem pojedynczej kopii w wirusie, podczas gdy poprzednie badania celowały w wewnętrzne powtarzające się długie zlokalizowane w regionie BamHI-W. Ponieważ w poliklonalnej proliferacji EBV liczba powtórzeń tego regionu jest niestała, nasz system jest uważany za dokładniejszy do ilościowego oznaczania EBV, choć mniej czuły w wykrywaniu. Wada niskiej czułości została przezwyciężona przez zastosowanie nested PCR. Czułość wynosiła 100 kopii na reakcję, w porównaniu z 10 kopiami w poprzednim raporcie. Określiliśmy ilościowo genomy EBV w PBL poprzez seryjne rozcieńczanie wyekstrahowanego DNA. Nasz system kwantyfikacji DNA EBV przez seryjne rozcieńczenia wyekstrahowanego DNA okazał się być powtarzalny i niezawodny.

PBL pobrana od dzieci z IM i z CAEBV była siedliskiem większych ilości genomu EBV niż PBL od zdrowych seropozytywnych kontroli. Spośród tych ostatnich, 47% miało wykrywalne DNA EBV (100-1000/2,5 × 105 PBL). EBV u 2 osób wykryto na wyższym poziomie niż w poprzednich badaniach (1-50/106 PBL). Ponieważ badaliśmy dzieci, krótszy okres od pierwotnego zakażenia może przyczynić się do wyższych ładunków EBV niż obserwowane w poprzednich badaniach dorosłych, przypominając nam, że, szczególnie u dzieci, pozytywne wyniki PCR obejmują bezobjawowe utajone zakażenie EBV.

Dzieci z IM miały duże ilości EBV. Ładunek EBV osiągał szczyt w ciągu miesiąca od wystąpienia choroby (1000-100,000 kopii/2.5 × 105 PBL), a następnie stopniowo się zmniejszał, ale pozostawał wysoki kilka miesięcy (⩽8) po wystąpieniu choroby, w porównaniu z poziomem u zdrowych osób z grupy kontrolnej. Nawet po ustąpieniu objawów klinicznych stosunkowo wysoki poziom replikacji EBV utrzymywał się w PBL.

Pacjenci z CAEBV mieli stale duże ilości EBV, co sugeruje, że przewlekła nieuregulowana aktywna replikacja EBV w PBL skutkuje ciężką chorobą o złym rokowaniu. Czynniki i mechanizmy prowadzące do zaskakująco aktywnej replikacji wirusa pozostają niejasne. Opisano różne heterogenne niedobory w systemach obronnych gospodarza, zarówno odporności humoralnej, jak i komórkowej, które mogą umożliwiać aktywną replikację wirusa. Wysokie obciążenie wirusem w PBL (>1300,000 EBV/105 PBL) zostało wykazane w związanej z EBV poprzeszczepowej chorobie limfoproliferacyjnej (PTLD), powikłaniu po transplantacji, chociaż obciążenie wirusem zmniejszyło się w ciągu roku, równolegle do powrotu do zdrowia po immunosupresji. Ilościowa różnica w ładunku krążącego EBV była skorelowana z poziomem przeciwciał EBNA w PTLD, ale nie w CAEBV. Dlatego uznano, że zachowanie EBV w PTLD jest zarówno podobne, jak i odmienne od zachowania w CAEBV. W świetle objawów klinicznych CAEBV wydaje się być podobny do zespołu limfoproliferacyjnego sprzężonego z chromosomem X (XLP), dla którego niedawno zidentyfikowano odpowiedzialny gen. Jednakże, w przeciwieństwie do zespołu XLP, CAEBV nie jest chorobą dziedziczną i może występować u kobiet. Dalsza analiza immunologiczna CAEBV jest konieczna w celu wyjaśnienia czynników predysponujących do aktywacji wirusowej.

Acyklowir, interferon-α i interleukina-2 były stosowane w leczeniu CAEBV – z niezadowalającymi wynikami. Nasze wyniki wskazują, że leki cytotoksyczne indukujące immunosupresję i nasilające aktywację wirusową powinny być dobierane ostrożnie, mimo że cechy kliniczne są podobne do tych występujących w nowotworach hematologicznych. Utrzymujące się wysokie obciążenia EBV w PBL są możliwym kryterium diagnostycznym dla CAEBV i mogą być przydatne do monitorowania aktywności choroby, do klasyfikowania choroby i do przewidywania rokowania.

Podziękowania

Dziękujemy George’owi Kleinowi (Centrum Mikrobiologii i Tumorbiologii, Instytut Karolinska, Sztokholm) za przejrzenie manuskryptu oraz Sachi Takemoto i Ai Kitamura za umiejętną pomoc techniczną.

> .