A Biology of p38 Kinase
Scieżka sygnałowa p38 MAPK jest jednym z najintensywniej badanych tematów w biologii od czasu jej wstępnej identyfikacji ponad 10 lat temu. Poziom zainteresowania tym szlakiem jest napędzany głównie przez dwa czynniki. Po pierwsze, szlak ten jest aktywowany przez szeroki wachlarz bodźców i ma związek z licznymi chorobami, w tym przede wszystkim z zapaleniem. Po drugie, wczesna dostępność selektywnych inhibitorów p38 dostarczyła krytycznych narzędzi wymaganych do dalszego określenia roli kinaz białkowych w szlakach sygnałowych oraz środków do wykorzystania potencjału terapeutycznego inhibicji p38. Rzeczywiście, w ciągu ostatnich 5 lat, duża liczba inhibitorów p38 weszła do badań klinicznych.
W czasie odkrycia kinazy p38 MAP, pierwszy członek rodziny kinaz MAP, kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), był już zidentyfikowany. Nie zdawano sobie jednak sprawy, że istnieją dwie dodatkowe podrodziny kinaz treoninowo-tyrozynowych o podwójnej specyficzności (p38 i JNK). W 1994 r. kilka grup badawczych niezależnie zidentyfikowało nową aktywność kinazową (Freshney i in., 1994; Han i in., 1994; Rouse i in., 1994;), a następnie klonowanie ludzkiego cDNA doprowadziło do identyfikacji p38 α (Lee i in., 1994). Wkrótce potem zidentyfikowano trzy inne warianty splice rodziny p38: p38β, P38y i p38h (Jiang i in., 1996, Jiang i in., 1997, Kumar i in., 1997). Dwa z członków rodziny, p38α i β, ulegają wszechobecnej ekspresji, ale są różnie regulowane w różnych typach komórek, podczas gdy pozostałe dwa są bardziej ograniczone w dystrybucji tkankowej. Do tej pory p38α, który został włączony w szereg chorób, jest najlepiej poznanym członkiem rodziny (patrz Kumar i in., 2003 oraz Saklatvala, 2004).
Aktywacja p38 została zaobserwowana w różnych organizmach jako odpowiedź na wiele bodźców. Ortologi p38α u drożdży, robaków i żab zostały włączone w osmoregulację, reakcje na stres i regulację cyklu komórkowego. Regulacja p38α w komórkach ssaków jest również dobrze zbadana (patrz Zarubin i Han, 2005). Obecnie wiadomo, że szlak sygnałowy p38α jest złożony i zależy nie tylko od bodźców i typu komórek, ale także od różnych regulatorów i kombinacji kinaz aktywujących. Wiadomo, że istnieją dwie główne kinazy aktywujące p38α, MKK3 i MKK6. Ponadto istnieje niezależny od MKK mechanizm aktywacji p38α, w którym bierze udział białko wiążące transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor activated protein kinase 1 – TAK1) (Ge i in., 2002). Aktywacja p38α może być osiągnięta poprzez autofosforylację po interakcji z TAB1. Sugeruje się również, że p38 negatywnie reguluje sygnalizację TAK1 poprzez fosforylację TAB1 (Cheung i in., 2003). Downstream sygnalizacji TAK1 jest IKK, który służy jako istotny etap aktywacji kinazy Tpl2 i jej celów downstream, MEK1 i ERK (Waterfield i in., 2004). Zahamowanie p38 powoduje zatem wzrost aktywności TAK1, co z kolei prowadzi do aktywacji ERK. Wyjaśnia to, dlaczego aktywacja ERK jest często obserwowana w komórkach poddanych działaniu inhibitorów p38α. Odkrycie to podkreśla potrzebę zrozumienia potencjalnego nieliniowego sprzężenia zwrotnego pomiędzy kinazowymi szlakami sygnalizacyjnymi. Oprócz TAK1, w aktywację p38α i jego bliskiego sąsiada, JNK, zaangażowane są również inne kinazy upstreamowe (MAP3K). Do procesu aktywacji przyczyniają się również małe białka wiążące GTP, takie jak Rac1 i Cdc42 oraz ich interakcje z PAK (p21-activated kinases) i MLK1.
Downstreamowymi substratami kinaz p38 MAP są MAPKAPK2 (Kotlyarov i in., 2002) i MAPKAPK3 (McLaughlin i in., 1996), które fosforylują różne substraty – w tym małe białko szoku cieplnego 27 (HSP27), białko specyficzne dla limfocytów 1 (LSP1), białko wiążące element odpowiedzi cAMP (CREB), czynnik transkrypcyjny (ATF1), SRF i hydroksylazę tyrozynową. Na szczególną uwagę zasługuje substrat MAPKAPK2 – tritetraprolina, białko destabilizujące mRNA (Tchen i in., 2004). MNK jest kolejnym substratem p38, który wydaje się być zaangażowany w inicjację translacji, ponieważ fosforyluje eIF-4E (Waskewicz i in., 1997). Ponadto wiadomo, że kinaza aktywowana p38 (PRAK) oraz kinaza białkowa aktywowana mitogenami i stresem (MSK1) są również aktywowane przez p38α, chociaż MSK1 jest również aktywowana przez ERK (Deak i in., 1998). Nic dziwnego, że istnieje duża liczba czynników transkrypcyjnych, które są regulowane przez p38 (przegląd w Zarubin i Han, 2005). Niektóre przykłady obejmują aktywujące czynniki transkrypcyjne 1, 2, i 6, białko pomocnicze SRF (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, czynnik wzmacniający miocyty 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT i białko High Mobility Group-box (HBP1). Wykazano również, że inne niepowiązane białka, takie jak cPLA1, izoforma-1 wymiennika Na+/H+ (NHE-1), tau, keratyna 8 i stathmina są substratami dla p38α.
Mechanizm, za pomocą którego inhibitory kinazy p38 MAP hamują ekspresję cytokin zapalnych, pozostaje nieuchwytny. Ekspresja genów zapalnych jest silnie regulowana zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i posttranskrypcyjnym. Wczesne badania nad działaniem inhibitorów p38 w ludzkich monocytach sugerowały, że regulacja biosyntezy cytokin zapalnych (głównie IL-1 i TNF) zachodzi na poziomie posttranskrypcyjnym. Następnie okazało się, że inhibicja szlaku p38 może negatywnie wpływać na stabilność mRNA (Frevel i in., 2003). Obserwacja ta skłoniła do dalszych badań, które wykazały, że w podobny sposób oddziałuje się na inne białka odpowiedzi zapalnej, takie jak COX-2 (Lasa i in., 2000). Do innych mRNA stabilizowanych przez p38 należą MIP-1a, gm-CSF, VEGF oraz MMP-1 i -3 (Dean i in., 2004). Co ciekawe, MAPKAPK-2, substrat dla p38, jest również zaangażowany w stabilizację mRNA przez p38. Katalitycznie aktywne formy MAPKAPK-2 stabilizują reporterowe mRNA, podczas gdy dominująco ujemna MAPKAPK-2 blokuje jego ekspresję (Winzen i in., 1999).
Wspólną cechą cech strukturalnych wpływających na stabilność mRNA jest motyw AU-rich w przedłużonym 3′UTR. Motyw ten został po raz pierwszy opisany przez Shaw i Kamena (1986). Istnieją trzy odrębne klasy takich elementów bogatych w AU (ARE): jedna zawiera niewielką liczbę ARE (takich jak c-Fos), druga zawiera większą liczbę ARE posiadających wiele pentamerów (takich jak TNFα, COX-2, itd.), a trzecia klasa zawiera ARE pozbawione pentamerów, ale zawierające regiony bogate w U. ARE kierują mRNA do szybkiej deadenylacji w komórkach. Generalnie, ARE regulowane przez p38 maj± podobne motywy strukturalne z licznymi, nakładaj±cymi się pentamerami w 3′UTR. Istniej± jednak wyj±tki, takie jak MMP-1 i -3 (Reunanen i in., 2002) oraz tristetraprolina (Mahtani i in., 2001, Tchen i in., 2004), mRNA zawieraj±ce przynajmniej jedn± pentamerę oraz sekwencje bogate w U. Dokładny mechanizm, za pomocą którego p38 reguluje stabilność mRNA pozostaje niejasny. Uważa się, że uczestniczy w nim kinaza MAPKAPK-2, jak również nieuchwytne białko wiążące ARE. Istnieje szereg kandydatów (Dean i in., 2004), ale żaden z nich nie spełnia wszystkich kryteriów, aby być białkiem, które łączy szlaki p38 i mRNA zawierające ARE. Spośród nich, tristetraprolina jest interesującą możliwością, chociaż służy głównie jako „wyłącznik” w stabilizacji mRNA.
Duża ilość danych z badań przedklinicznych wskazuje na centralną rolę p38 w odpowiedziach immunologicznych i zapalnych (Dong i in., 2002; Kracht i Saklatvala, 2002; Kumar i in., 2003). Obecnie wiadomo, że szlak p38 jest selektywnie aktywowany w efektorowych komórkach T Th1 w odpowiedzi na IL-12 i IL-18. Produkcja cytokin Th1, takich jak interferon gamma, jest hamowana przez inhibitory p38, podczas gdy produkcja IL-4, cytokiny Th2, nie jest hamowana. W makrofagach wiele cytokin zapalnych, takich jak TNF, IL-1, IL-6 i IL-8, jest regulowanych przez szlaki p38. Znokautowany MKK3 mysi fibroblast embrionalny reaguje na TNF, ale nie na IL-1, UV lub sorbitol, wskazując tym samym na rolę MKK3 w działaniu TNF, ale nie IL-1. W fibroblastach mysich zarodków knock-out p38α, jednakże, indukowana IL-1 produkcja IL-6 jest poważnie upośledzona. Dane te sugerują, że różne ligandy będą wywoływać funkcje różnych kinaz w szlaku p38. Wraz z dużą ilością dowodów genetycznych i farmakologicznych in vivo, wyniki te wspierają p38 jako ważny cel, którego inhibicja mogłaby zapewnić korzyści terapeutyczne w różnych chorobach zapalnych, szczególnie w reumatoidalnym zapaleniu stawów (Foster et al., 2000). Inne możliwości interwencji farmakologicznej obejmują przerost serca, chorobę Alzheimera, uszkodzenie naczyń krwionośnych, łuszczycę i nieswoiste zapalenia jelit.