Podstawowo, hodowla komórkowa obejmuje dystrybucję komórek w sztucznym środowisku (in vitro), które składa się z niezbędnych składników odżywczych, idealnej temperatury, gazów, pH i wilgotności, aby umożliwić komórkom wzrost i rozmnażanie.

• In vivo – gdy badanie dotyczy żywych jednostek biologicznych w organizmie.

• In vitro – gdy badanie jest prowadzone przy użyciu jednostek biologicznych (komórek, tkanek itp.), które zostały odizolowane od ich naturalnego środowiska biologicznego. Np. tkanka lub komórki wyizolowane z wątroby lub nerki.

Gdzie kawałki tkanki mogą być umieszczone w odpowiedniej kulturze w celu wytworzenia komórek, które mogą być następnie wykorzystane do hodowli (explantculture), komórki z tkanek (tkanek miękkich) mogą być uzyskane poprzez reakcje enzymatyczne. Enzymy takie jak trypsyna i proname są wykorzystywane do rozbicia tkanki i uwolnienia pożądanych komórek.

Gdy komórki zostały uzyskane bezpośrednio z organizmu/tkanki zwierzęcej (lub nawet tkanki roślinnej) poprzez techniki enzymatyczne lub mechaniczne, takie komórki są określane jako komórki pierwotne. Jednakże komórki, które kontynuują proliferację w nieskończoność (po pierwszej subkulturze) w specjalnych warunkach są określane jako linie komórkowe.

Te szczególne komórki wydają się być poddawane pasażowaniu przez długi okres czasu, co powoduje, że nabywają one homogeniczne (podobne) cechy genotypowe i fenotypowe.

Morfologia

Based on their appearance, cells in culture can becategorized in to three main groups:

• Fibroblastic – Thisincludes cells that tend to be bipolar/multipolar with elongated shapes. Thesecells are attached to the substrate as they grow.

• Epithelial – Epitheliallike cells attain a polygonal shape with regular dimensions. Chociaż mają tendencję do wzrostu w dyskretnych płatach, komórki te rosną również przytwierdzone do podłoża.

• Lymphoblast – Komórki te mają zwykle kulisty kształt i nie przytwierdzają się do powierzchni podłoża. W rezultacie, są hodowane w zawiesinie.

* W przypadku płytek stałych, środki zestalające (takie jak agar) są stosowane, gdy płynne media są używane z agarem.

Znaczenie hodowli komórkowych

Hodowla komórkowa jest ważną techniką zarówno w biologii komórkowej, jak i molekularnej, ponieważ zapewnia najlepszą platformę do badania normalnej fizjologii i biochemii komórek. Komórka jest podstawową jednostką strukturalną, funkcjonalną i biologiczną wszystkich istot żywych.

W celu lepszego zrozumienia organizmu lub danych tkanek, ważne jest, aby zrozumieć, jak działają jej komórki. Dzięki hodowli komórkowej staje się to możliwe, zwłaszcza dzięki temu, że komórki pierwotne przypominają komórki macierzyste organizmu/tkanki.

Cokolwiek dowiemy się o komórkach in vitro jest reprezentatywne dla tego, co dzieje się z organizmem/tkanką. To sprawia, że hodowla komórkowa jest bardzo ważna dla rozwoju szczepionek, badań przesiewowych (leków itp.) i diagnozowania danych chorób/stanów chorobowych.

Zważywszy, że różne typy komórek wymagają różnych środowisk do proliferacji, istnieją różne rodzaje mediów używanych do hodowli, takie jak media bez surowicy i media zawierające surowicę, między innymi.

Po zapewnieniu odpowiednich wymagań, komórki będą rosły w liczbach i mogą tworzyć kolonie, które mogą być łatwo zauważone i zidentyfikowane.Jednakże, wszystko to wymaga zrozumienia celu procedury.

Dobrze rozumiejąc, co procedura ma osiągnąć, łatwiej jest przygotować hodowlę z odpowiednich składników. Rozumiejąc, do czego zmierza procedura, badacz będzie wiedział, czy przygotować pożywkę selektywną (pozwalającą na wzrost określonych komórek), czy obojętną (pozwalającą na wzrost różnych typów komórek).

Pierwotna hodowla komórkowa

Hodowla komórkowa jest procesem, w którym komórki (zwierzęce lub roślinne) są usuwane z organizmu i wprowadzane do sztucznego środowiska o korzystnych warunkach wzrostu. Pozwala to badaczom badać i uczyć się więcej o komórkach.

Istnieją trzy główne typy hodowli komórkowych, które obejmują:

• Pierwotna hodowla komórkowa
• Podstawowa hodowla komórkowa, i
• Linia komórkowa

Tutaj skupimy się na pierwotnej hodowli komórkowej.

Istnieją dwa typy komórek pierwotnych:

Komórki przylegające – określane również jako komórki zależne od miejsca zakotwiczenia, są to typy komórek, które wymagają przyłączenia do wzrostu. Komórki przylegające są nieruchome i są uzyskiwane z takich narządów jak nerki.

Komórki zawieszone – Są to komórki, które nie wymagają przywiązania w celu wzrostu. Dlatego są one również określane jako komórki niezależne od zakotwiczenia i obejmują takie komórki jak limfocyty występujące w układzie krwionośnym.

W pierwotnej hodowli komórkowej, komórki uzyskane z takich tkanek macierzystych (tkanek żywych) jak wątroba i nerka, są wprowadzane do odpowiednich pożywek w celu wzrostu. Po uzyskaniu komórek, mogą być one hodowane jako eksplantaty, zawiesiny lub monowarstwy.

* W pierwotnej hodowli komórkowej, komórki muszą być uzyskane z tkanki macierzystej/żywej. Oznacza to, że nie pochodzą z innego procesu hodowlanego.

Przed hodowaniem komórek, są one najpierw poddawane działaniu enzymów w celu dysocjacji. Jednakże, musi to być aminimalna ilość czasu, aby uniknąć uszkodzenia lub zabicia komórek. Gdy pojedyncze komórki są uzyskane, są one następnie odpowiednio hodowane w mediach, aby umożliwić imto rosnąć (podział) są osiągnąć pożądane numery.

Początkowo, kultura ma tendencję do bycia heterogenicznymin, że składa się z różnych typów komórek uzyskanych z tkanki.Chociaż może to być utrzymywane przez proces in vitro (w kulturze w odpowiednich mediach), to tylko przez ograniczony okres czasu.

Przez proces transformacji, komórki pierwotne mogą być używane przez długiperiod czasu, zmieniając kulturę w czasie. Komórki te są określane jako ciągłe linie komórkowe.

Jednakże, komórki pierwotne są zazwyczaj preferowane w stosunku do ciągłych linii komórkowych z uwagi na fakt, że są one bardziej podobne (fizjologicznie) do komórek invivo (komórki z żywej tkanki). Dodatkowo, ciągłe linie komórkowe mogą ulegać pewnym zmianom (zmiany fenotypowe i genotypowe), które spowodowałyby rozbieżności podczas analizy. W związku z tym, nie mogą być one użyte do określenia, co dzieje się z komórkami in vivo. Z tego powodu preferowane są komórki pierwotne.

Zważywszy, że komórki pierwotne znacznie przypominają komórki uzyskane z żywej tkanki, są one ważne dla celów badawczych, ponieważ mogą być wykorzystane do badania ich funkcji, regulacji metabolicznych, fizjologii komórek, rozwoju, wad i warunków wpływających na tkanki będące przedmiotem zainteresowania.

Są one również wykorzystywane do takich celów jak produkcja szczepionek, badania przesiewowe leków w inżynierii genetycznej, jak również badania toksyczności i diagnostyka prenatalna, między innymi.

Podłoża do hodowli komórkowych

W technikach hodowli komórkowych, komórki (lub tkanki) są usuwane z rośliny lub zwierzęcia i wprowadzane do nowego, sztucznego środowiska, które może wspierać ich proliferację (przeżycie i wzrost).

Niektóre z wymagań takiego środowiska dla proliferacji komórekinclude:

• Podłoże (źródło odżywiania)
• Idealny zakres temperatur(kontrolowany)
• Podłoże wzrostowe, oraz
• Idealne pH między innymi

Tutaj, skupimy się na pożywce (cell culturemedia)

Ale istnieją różne rodzaje pożywek (dla różnych typów komórek), zazwyczaj składają się one z:

• Glukoza
• Aminokwasy
• Witaminy
• Sole nieorganiczne
• Czynniki mocujące Etc.

Istnieją dwa główne typy podłoży hodowlanych. Należą do nich:

Podłoża naturalne – Naturalne podłoża hodowlane składają się z płynów biologicznych, które występują naturalnie. Chociaż ten typ pożywki może być używany dla wielu komórek, jego największą wadą jest to, że może brakować w nim dokładnych składników wymaganych przez dane komórki, co może mieć duży wpływ na odtwarzalność.

Pożywki sztuczne – określane również jako pożywki syntetyczne, pożywki sztuczne odnoszą się do typu pożywki, która jest produkowana przez dodanie takich składników odżywczych jak witaminy, gazy (tlen i dwutlenek węgla) i białka, między innymi. Te organiczne i nieorganiczne składniki odżywcze są dodawane w taki sposób, aby zaspokoić specyficzne potrzeby danych komórek, a tym samym zapewnić idealne środowisko dla ich wzrostu.

Jako takie, mogą być stosowane do wielu celów, w tym:

• Zapewnienie natychmiastowego przeżycia komórek
• Pozwolenie na przedłużone przeżycie komórek
• Pozwolenie na nieograniczony wzrost komórek
• Zapewnienie wyspecjalizowanych funkcji

Z drugiej strony, hodowle mogą być skategoryzowane jako:

Podłoża selektywne- Jest to specjalny rodzaj podłoża, które pozwala na wzrost tylko niektórych komórek. Na przykład, agar z krwią (używany do izolowania Streptococcus & Moraxella species) może być przekształcony w podłoże selektywne poprzez dodanie antybiotyków.

Podłoże różnicujące- Ten typ podłoża pozwala na wzrost różnych typów komórek/mikroorganizmów w zależności od ich metabolizmu.

Jak wspomniano powyżej, różne typy syntetycznych podłoży są przygotowywane w sposób, który zapewni idealne środowisko proliferacyjne dla danych komórek. Z tego powodu, syntetyczne media mogą być podzielone na cztery główne kategorie.

Obejmują one:

Podłoża zawierające surowicę – W tych typach podłoży, surowica (płodowa surowica bydlęca) jest używana jako nośnik dla składników odżywczych i czynników wzrostu między innymi, które mają tendencję do bycia nierozpuszczalnymi w wodzie.

Podłoże bez surowicy – Tego typu podłoża są zazwyczaj produkowane w celu wspierania hodowli pojedynczych komórek. Jako takie, dostarczają one określonych składników odżywczych i innych czynników wymaganych przez dany typ komórek. W tych podłożach surowica jest nieobecna, ponieważ ma ona pewne wady i może powodować błędną interpretację wyników immunologicznych.

Podłoże chemicznie zdefiniowane – Jak sama nazwa wskazuje, ten typ podłoża składa się z wolnych od zanieczyszczeń, czystych składników organicznych i nieorganicznych. Składniki tego typu pożywek są zazwyczaj produkowane poprzez inżynierię genetyczną w bakteriach/drożdżach.

Podłoża bezbiałkowe – Pożywki bezbiałkowe są typowo pozbawione jakiegokolwiek rodzaju białka. Są one w dużej mierze używane do promowania lepszego wzrostu komórek, jak również ekspresji białek w dodatku do ułatwiania oczyszczania każdego wyrażonego produktu.

Niektóre z głównych składników podłoża do hodowli komórkowych obejmują:

• Składniki odżywcze – dostarczane do bypeptydów i aminokwasów, które są budulcem białek
• Węglowodany dla energii
• Niezbędne minerały takie jak wapń, magnez, fosforany i żelazo, między innymi środki buforujące, takie jak octany do stabilizacji mediów hodowlanych
• Witaminy
• Wskaźniki zmiany pH, takie jak czerwień fenolowa

Podłoża do hodowli komórkowych są używane do proliferacji komórek, które mogą być następnie identyfikowane i badane. Jako takie, mogą być stosowane do różnych celów, w tym do edukacji, diagnozowania i leczenia chorób, między innymi.

Zawiesina komórkowa

W metodach hodowli, zawiesina komórkowa odnosi się do typu hodowli, w której komórki są zawieszone w płynnym medium.

Aby uzyskać pojedyncze komórki, kruchy kalus (mała tkanka, która łatwo się rozpada) jest umieszczany w mieszanym medium ciekłym (mieszanie pozwala na wymianę gazową w przeciwieństwie do medium stałego), rozbijając go. To pozwala na uwolnienie pojedynczych komórek, które są następnie przenoszone do innego świeżego medium.

Kultury zawiesinowe komórek mają dużą przewagę nad stacjonarnymi, ponieważ pozwalają na równomierną kąpiel komórek. Ponadto, biorąc pod uwagę, że medium ma tendencję do mieszania, pozwala to na napowietrzanie medium, dostarczanie gazów do komórek. Biorąc pod uwagę, że pożywka jest zawiesiną, łatwo jest również manipulować zawartością hodowli.

Jak każda inna kultura, hodowla komórek w zawiesinie musi być w kontrolowanych warunkach, co zapewnia komórkom idealne środowisko do rozmnażania. Po osiągnięciu około 80 procent konfluencji, czas na podhodowle w celu zapewnienia dalszego prawidłowego wzrostu.

* 80 procent konfluencji odnosi się do stanu, w którym 80 procent powierzchni hodowli jest pokryte rosnącymi komórkami.

W niektórych przypadkach, komórki w zawiesinie mogą przylegać do plastikowej powierzchni kolby hodowlanej lub nawet tworzyć grudki. W takich przypadkach można użyć pipety do pobrania tych komórek i wyrzucenia ich na powierzchnię kolby, a zatem z dala od plastikowej powierzchni. Pomaga to w uzyskaniu pojedynczych komórek, ponieważ nie przylegają one do powierzchni plastiku.

Zawiesina krwinek czerwonych

• (po lewej: bez hemolizy) Zawiesina krwinek czerwonych (0,5% owczych RBC w soli fizjologicznej), wydaje się czerwona i nieprzezroczysta.
• (w środku: bez hemolizy) RBC sedymentowały spontanicznie przez 60 min. Zauważ, że supernatant nie jest zabarwiony.
• (po prawej: hemoliza) Zawiesina RBC traktowana hemolizyną S. pyogenes w temperaturze 37C przez 30 min, staje się przezroczysta przez hemolizę.

Zobacz więcej na temat krwinek czerwonych

Liczenie komórek

Obliczanie liczby komórek w zawiesinie jest procesem, który wymaga użycia barwnika. Na przykład, gdy używany jest błękit trypanu, przenika on przez błonę komórkową martwych komórek, ale nie komórek żywych.

Komórki są następnie delikatnie wydalane do hemocytometru (zawierającego komorę liczenia) pod szkiełkiem nakrywkowym i obserwowane pod mikroskopem. Cellsare następnie policzone w ramach danej liczby kwadratów do obliczeń.

Znaczenie

Ta metoda jest w dużej mierze preferowane ze względu na fakt, że pozwala na komórki być zawieszone w roztworze, a nie jest heldin stałych mediów. W ten sposób łatwiej jest manipulować ich zawartością, zapobiegając tworzeniu się skupisk. W przypadku zawiesin komórkowych, łatwiej jest również obserwować pojedyncze komórki pod mikroskopem.

W tym przypadku, staje się możliwe nie tylko badanie struktury komórek, ale także obserwowanie jak dobrze się zróżnicowały; oglądanie martwych i żywych komórek pod mikroskopem.

Protokoły hodowli komórkowych

Protokoły hodowli komórkowych mają na celu zapewnienie, że procedury hodowli są przeprowadzane zgodnie z wymaganymi standardami. Ma to na celu nie tylko zapobieganie skażeniu komórek, ale także zapewnienie, że sami badacze są chronieni przed jakąkolwiek formą skażenia.

Co więcej, oczekuje się, że charakter pracy będzie zgodny z odpowiednimi wytycznymi etycznymi. Dlatego też, przed wszystkim innym, konieczne jest zapewnienie, że cała procedura jest zgodna zarówno z wytycznymi medyczno-etycznymi, jak i wytycznymi dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach. Dzieje się tak dlatego, że postępowanie wbrew takim przepisom i wytycznym może skutkować wysokimi karami, a nawet zamknięciem laboratorium.

Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek pracy należy wykonać następującą procedurę:

• Ensure that the working areis sanitized (using 70 percent ethanol)
• Always use a new pair ofgloves. Jeśli para rękawic musi być użyta do innej procedury hodowli komórkowej, powinna być odkażona przy użyciu 70-procentowego etanolu i pozostawiona do wyschnięcia na powietrzu.
• Wszelkie wyposażenie, które zostało wyjęte z szafki, powinno być również zdezynfekowane, aby zapobiec wszelkim zanieczyszczeniom
• Sprzęt taki jak pipety, szklane słoiki i tworzywa sztuczne, które mają być użyte do procedury, powinny być autoklawowane

Pomimo że istnieje szeroki zakres podłoży do hodowli komórek, ważne jest, aby pamiętać, że hodowle komórkowe, a w szczególności pierwotne hodowle komórkowe są łatwo podatne na skażenie, a ponadto istnieje ryzyko, że mogą zawierać niewykryte wirusy. Z tego powodu, cały materiał powinien być traktowany jako potencjalnie zakaźny w celu uniknięcia jakichkolwiek infekcji.

W dodatku, dla celów bezpieczeństwa, praca nad kulturą komórkową powinna być prowadzona w odpowiednim wyciągu z przepływem laminarnym, gdzie powietrze jest skierowane z dala od badacza.

Protokoły przygotowania hodowli komórkowej

Zawsze należy sprawdzić informacje na pojemniku, aby upewnić się, że pożywka jest odpowiednia dla hodowanej komórki,

Po przygotowaniu, hodowla komórkowa powinna być utrzymywana w zalecanym zakresie temperatur,

Monitorować hodowlę co 30- 48 godzin i sprawdzać konfluencję (kiedy komórki całkowicie pokrywają powierzchnię hodowli) – Jednakże, jest to w dużej mierze zależne od rodzaju komórek.

Po zakończeniu procedury i przeanalizowaniu komórek, hodowla powinna być odpowiednio wyrzucona. W tym przypadku należy zachować dużą ostrożność, ponieważ do tego czasu komórki zdążyły się już rozmnożyć i zwiększyć swoją liczebność. Co więcej, istnieje duże prawdopodobieństwo, że próbka została zanieczyszczona, co zwiększa ryzyko infekcji u badacza, jeśli nie będzie się z nią odpowiednio obchodzić.

Utylizacja

• W przypadku takich przedmiotów jak skalpele, szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe między innymi, de- skażenie może obejmować autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 psi (ciśnienie) przez co najmniej 30 minut. Jednakże, jeżeli mają być wyrzucone, ważne jest, aby były umieszczone w plastikowej torbie i w odpowiednim pojemniku do późniejszego spalenia.
• W przypadku odpadów płynnych, dezynfekcja chemiczna jest jedną z najlepszych metod, dzięki której produkt odpadowy może być dezaktywowany. Takie środki chemiczne jak wybielacz mogą być użyte w tym celu przed wylaniem cieczy do odpływu zlewu.
• W przypadku odpadów stałych, są one zbierane do plastikowej torby w celu spalenia. Z drugiej strony, mogą one być najpierw autoklawowane przed spaleniem.

Conclusion

Ogólnie, hodowla komórkowa, czy to z użyciem zawiesiny czy mediów stacjonarnych, obejmuje wzrost komórek w sztucznym środowisku o korzystnych warunkach. Podczas gdy działanie enzymatyczne może być wykorzystane do uzyskania komórek do hodowli, jest to mechaniczna metoda dezagregacji, która jest najbardziej preferowana, ponieważ zapewnia prostszy i mniej traumatyczny sposób uzyskania komórek.

Ta metoda po prostu obejmuje krojenie tkanki na mniejsze kawałki, z których następnie zbiera się rozlane komórki. Również, technika eksplantatów pierwotnych może być użyta do uzyskania komórek. Jednakże ta metoda jest głównie przydatna do dezagregacji mniejszych ilości tkanki.

While jakiekolwiek komórki mogą być wykorzystane w hodowlach do obserwacji ich zachowania, tkanki embrionalne są preferowane (dla komórek pierwotnych) w porównaniu z komórkami dorosłymi, ponieważ dostarczają komórek, które są bardziej żywotne i mogą szybko się rozmnażać.

Tutaj, ważne jest również zapewnienie, że komórki są w większej ilości biorąc pod uwagę, że ich wskaźnik przeżycia ma tendencję do bycia niższym w porównaniu do podhodowli. I

W celu zwiększenia sukcesu hodowli, ważne jest również zapewnienie, że uszkodzenia komórek są zminimalizowane zarówno podczas zbierania komórek jak i przetwarzania. Jest to dodatek do używania odpowiedniego medium dla komórek, o których mowa.

W tych samych liniach, spójrz na rodzaje i techniki hodowli tkanek.

Sprawdź MicroscopeMaster’s picks for Microscope Accessories.

Jak również informacje na temat podziału komórek, różnicowania komórek i barwienia komórek i uzyskać pewien wgląd w teorię komórek.

Dla bardziej zaawansowanych i świetna lektura to Biologia Molekularna Komórki. Jak również nauka o Cytochemii.

Może jesteś studentem, nauczycielem lub hobbystą i chcesz śledzić informacje MicroscopeMaster na temat zabawnych eksperymentów mikroskopowych.

Zobacz także Kulturę Mikroskopową i Testowanie Czułości

Powrót z Kultury Komórkowej do Strony Głównej Biologii Komórki

Powrót z Kultury Komórkowej do Domu MicroscopeMaster

.