Abstract

This paper reports a case of myiasis caused by Hypoderma sinense in a European man returning from a journey through northern India. U pacjenta stwierdzono eozynofilię, ogólnoustrojowe objawy zapalenia oraz bolesne obrzęki w kilku częściach ciała. Diagnoza została potwierdzona specyficznym badaniem serologicznym i identyfikacją molekularną pasożyta.

Rodzaj Hypoderma (Diptera: Oestridae) obejmuje siedem gatunków muchówek, które w stadium larwalnym mogą wywoływać grzybicę wewnętrzną. U przeżuwaczy domowych i dzikich choroba charakteryzuje się występowaniem podskórnych brodawek w okolicy grzbietowej i lędźwiowej. 1 Przypadki hipodermozy u ludzi były związane z podskórną pełzającą grzybicą, 2 oftalmomiozą, 3 i zapaleniem opon mózgowych, 4 chociaż najczęstszymi objawami są alergie skórne z towarzyszącą eozynofilią. 5,6 W Chinach hipodermoza jest jednym z najważniejszych zakażeń stawonogami u bydła i jaków, zwłaszcza w północnych regionach kraju 7, gdzie częstość jej występowania może sięgać od 90% do 100%. W niektórych przypadkach na jedno zwierzę może przypadać 400 larw. 8 W tych samych rejonach odnotowano najwyższą znaną częstość występowania hipodermozy u ludzi (0,4%-7%, u rolników). 9 W kilku krajach europejskich, leczenie preparatami iwermektyny do wstrzykiwania lub podawania doustnego było stosowane do zwalczania hipodermozy bydła na terenie całego kraju (przegląd w Boulard et al. 10 ), co doprowadziło do zmniejszenia częstości występowania zakażenia do zaledwie 0,5%. Rzeczywiście, w Wielkiej Brytanii, Irlandii i Danii hipodermoza bydła została wyeliminowana. W związku z tym, liczba doniesień o zarażeniu ludzi przez Hypoderma spp. znacznie się zmniejszyła. 11 Jednak rosnące przemieszczanie się ludzi na świecie, w szczególności do i z krajów rozwijających się, może narażać podróżnych na kontakt z tymi „egzotycznymi” patogenami.

W niniejszej pracy opisano przypadek importowanej hipodermozy u mężczyzny z Europy powracającego z północnych Indii. U pacjenta wystąpiły ciężkie objawy, które klinicznie przypominały objawy innych parazytoz, co doprowadziło do początkowego błędnego rozpoznania filariozy limfatycznej, gnathostomiazy i sparganozy. Chirurgiczna ekstrakcja larw sugerowała rozpoznanie prawdopodobnej grzybicy, ale dopiero test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) na obecność anty-Hypoderma potwierdził diagnozę. Czynnik sprawczy został zidentyfikowany jako Hypoderma sinense metodami molekularnymi.

Raport przypadku

Pacjentem był 34-letni Hiszpan, który podróżował do Ladakh, górzystego obszaru w północnych Indiach, jako przewodnik turystyczny w sierpniu 2006 roku. Na tym terenie hodowane są kozy i jaki. W październiku 2006 r. pacjent zaczął odczuwać dyskomfort i ból brzucha. Miesiąc później zaczął cierpieć z powodu bolesnego zapalenia w prawej pachwinie i okolicy jąder. Pacjent był początkowo leczony w szpitalu w Madrycie, gdzie został poddany badaniom ultrasonograficznym, tomografii komputerowej (CT) i rezonansu magnetycznego (MRI). Ujawniły one zapalenie prawego powrózka nasiennego oraz adenopatię biodrową i pachwinową. U pacjenta stwierdzono również znaczną eozynofilię (5 100 eozynofilów/µL, 31,2%). Badania poziomu mikrofilarii we krwi w dzień i w nocy dały wynik ujemny, podobnie jak specyficzna dla filariozy reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), testy na obecność pasożytów w kale i moczu oraz testy serologiczne na obecność pasożytów (filarioza, włośnica, toksokaroza, anizakaroza, strongyloidoza), bakterii (bruceloza, salmonelloza, tuberkulina, prątki w moczu) i wirusów. Pomimo wyników badań laboratoryjnych wysunięto podejrzenie filariozy limfatycznej i zastosowano albendazol (jednorazowa dawka 400 mg) oraz dietylkarbamazynę (6 mg/kg/d/15 d) plus prednizon (60 mg/d/5 d). Po rozpoczęciu leczenia prednizonem liczba eozynofilów znacznie się zmniejszyła do 100/µL (0,4%), by po zawieszeniu leczenia ponownie wzrosnąć do 2 590/µL (21,1%).

W styczniu 2007 roku pacjent został skierowany do Szpitala Carlosa III w Madrycie, tym razem z powodu obrzęku lewego uda. W wywiadzie podał, że podczas letniej podróży zauważył lekko bolesne, przemijające (trwające 2-7 dni), rumieniowe obrzęki skórne w różnych miejscach. W badaniu przedmiotowym stwierdzono obrzęki w prawym powrózku nasiennym, w górnej trzeciej części lewego uda oraz w lewym boku (ryc. 1). Pacjent nigdy nie gorączkował. W momencie konsultacji leczenie prednizonem było zawieszone na 2 tygodnie, a liczba eozynofilów wynosiła 7000/µL (41%). Wykonano badania bezpośrednie (tj. poziom mikrofilarii we krwi i pasożytów w kale), serologiczne (tj. anizakiaza, filarioza, schistosomatoza, trychinelloza, toksokaroza, fascioloza, bąblowica i gnathostomatoza) oraz parazytologiczne. W przypadku ostatniego z tych badań, próbka została wysłana do Międzynarodowego Centrum Referencyjnego Gnathostomiasis w Tajlandii. Ponieważ podejrzewano gnathostomiasis, pacjent był hospitalizowany i leczony albendazolem (400 mg/12 h/3 tyg.). Aby uniknąć maskowania eozynofilii, nie podawano kortykoidów. Pacjent został poinformowany, że leczenie odrobaczające może spowodować mobilizację pasożytów w kierunku powierzchni ciała, co umożliwi ich chirurgiczne usunięcie i identyfikację, a tym samym pozwoli na ustalenie odpowiedniego sposobu leczenia. Pięć dni po leczeniu, obrzęki skórne pacjentki stały się bardzo bolesne i pojawiły się dwie zmiany guzkowe, jedna w okolicy pośladków, a druga na plecach. Skanowanie ultradźwiękowe ujawniło robakopodobnego pasożyta wewnątrz każdego obrzęku. Te dwa białawe pasożyty o owalnym kształcie (odpowiednio 10 × 3 mm i 6 × 2 mm) zostały usunięte chirurgicznie. Analiza morfologiczna fragmentu jednego z pasożytów sugerowała, że może to być larwa muchy (ryc. 1). Druga próbka została poddana badaniu histologicznemu, ale nie dało ono przydatnych wyników. Pięć dni po rozpoczęciu leczenia albendazolem liczba eozynofilów osiągnęła 29,800/µL (78%), co zbiegło się z wystąpieniem silnego bólu spowodowanego obrzękami skórnymi. Po zakończeniu leczenia albendazolem liczba eozynofilów zmniejszyła się do 18 897/µL (67%). W związku z tym rozpoczęto leczenie iwermektyną (12 mg/d/2 d) od 8 lutego 2007 roku. Liczba eozynofilów zmniejszyła się do 2900/µL (30%), a pacjent przez kilka dni pozostawał bezobjawowy, po czym na prawej nodze pojawił się kolejny bolesny obrzęk, a liczba eozynofilów wzrosła do 3100/µL (34%). Leczenie iwermektyną powtórzono 3 marca 2007 roku, a kilka dni później liczba eozynofilów zmniejszyła się do 1 600/µL (20,6%). W międzyczasie potwierdzono ujemną serologię w kierunku Gnathostoma. Pięć dni po drugim leczeniu iwermektyną w różnych częściach ciała ponownie pojawiły się bardzo bolesne obrzęki skórne, które utrudniały pacjentowi wykonywanie normalnych czynności. Zdecydowano więc o zastosowaniu empirycznego leczenia potencjalnej sparganozy, opierając się na podobnych przypadkach klinicznych opisanych w literaturze. 12 Leczenie prazykwantelem rozpoczęto 22 marca 2007 roku w dawce 75 mg/kg/dobę/3 dni, ale nie zaobserwowano istotnych zmian klinicznych ani zmniejszenia liczby eozynofilów. Kilka dni po rozpoczęciu leczenia uzyskano ujemny wynik badania serologicznego w kierunku sparganozy. Ponieważ u pacjenta nadal występowały silne, bolesne obrzęki skórne i hipereozynofilia, zastosowano trzecią turę iwermektyny (12 mg/d/3 dni). Po tym ostatnim leczeniu pacjent szybko stał się bezobjawowy. Obrzęki skórne nie pojawiły się ponownie, a liczba eozynofilów szybko się unormowała. Pacjent pozostaje bezobjawowy do dnia dzisiejszego, 2 lata później.

Wykrywanie przeciwciał anty-Hypoderma spp. Igg Antibodies

Ponieważ ani wielokrotne badania serologiczne, ani mikroskopowe nie były rozstrzygające, a analiza morfologiczna fragmentu larwalnego sugerowała występowanie grzybicy (ryc. 2), wykonano testy immunodiagnostyczne w kierunku hipodermozy, wykorzystując surowice retrospektywne i śledzące od pacjenta. Trzy kolejne próbki surowicy zostały wysłane do Laboratorium Szkoły Weterynaryjnej w Lugo. Przeciwciała anty-Hypoderma poszukiwano metodą pośrednią ELISA z użyciem surowego ekstraktu uzyskanego z pierwszych stadiów Hypoderma lineatum, jak opisali Panadero i wsp. 13 Różne rozcieńczenia antygenu, surowicy i immunokoniugatu badano zgodnie z wcześniej opisanym protokołem. 14 Swoistość procedury została oceniona poprzez badanie trzech ludzkich surowic pozytywnych dla Gnathostoma. Wysokie miana przeciwciał anty-Hypoderma zostały wykryte podczas przebiegu choroby (OD 4,359 w dniu 24 listopada 2006 r.), w 3 miesiącu po zakażeniu (p.i.) (w dniu 24 listopada 2006 r.) i po leczeniu (OD 3,977 w 7 miesiącu p.i. i 4,044 w 15 miesiącu p.i.). Te wysokie poziomy przeciwciał przeciwko antygenom H lineatum potwierdziły diagnozę zarażenia larwami pustułki.

Identyfikacja molekularna pasożyta

Genomowe DNA zostało wyekstrahowane z tkanek larwalnego pasożyta przy użyciu zestawu Quantum Prep AquaPure Genomic DNA Kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Hiperzmienna sekwencja genu oksydazy cytochromowej I (cox1) kodująca region od zewnętrznej pętli 4 (E4) do karboksy-końca (COOH) białka (688 bp) została amplifikowana metodą PCR, jak opisano wcześniej. 15 Produkty PCR wykrywano na 1,6% żelu agarozowo-tris-acetatowo-EDTA (TAE), oczyszczano przy użyciu kolumn Ultrafree-DA (Amicon, Billerica, MA, USA), a następnie bezpośrednio sekwencjonowano w sekwenatorze ABI-PRISM 377 przy użyciu zestawu Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Fragmenty mitochondrialne były sekwencjonowane w obu kierunkach. Sekwencje zostały wyrównane przy użyciu programu ClustalX i zbadane wzrokowo. Porównanie parami uzyskanych sekwencji wykazało, że są one identyczne z sekwencją H sinense cox1 dostępną w bazie GenBank™ (Accession number: AY350769).

Dyskusja

Jest to pierwsze doniesienie o rozpoznaniu zarażenia człowieka wywołanego przez larwy H sinense w Europie, u pacjenta powracającego z Indii. Jest bardzo prawdopodobne, że zarażenie nastąpiło w wyniku kontaktu z zarażonym bydłem lub jakami w regionie, który jest endemiczny dla hipodermozy – gdzie pacjent podróżował. Przypadki grzybicy u ludzi mogą wystąpić, gdy nowo wylęgłe larwy na sierści zarażonych zwierząt wejdą w kontakt z dłońmi lub gołymi ramionami. 2

Na podstawie objawów klinicznych występujących u pacjenta we wczesnej fazie zarażenia i biorąc pod uwagę wyniki uzyskane w różnych badaniach diagnostycznych, wstępnie postawiono przypuszczalne rozpoznanie gnathostomiazy, a następnie sparganozy. Ponieważ choroby te są bardzo rzadkie w Hiszpanii, badania serologiczne nie były natychmiast dostępne, ale zastosowano leczenie empiryczne. Cechy morfologiczne fragmentu usuniętej chirurgicznie larwy sugerowały zarażenie przez Hypoderma spp. Identyfikacja różnych gatunków Hypoderma opiera się na badaniu cech morfologicznych larw, 16,17 ale mały rozmiar fragmentu utrudniał pełną identyfikację. Jednak obecność wysokich mian przeciwciał anty-H lineatum w surowicy pacjenta (wykrywanych metodą ELISA w różnym czasie) wskazywała na zarażenie larwami Hypoderma, potwierdzając wcześniejsze morfologiczne podejrzenie miiazy. Ocena reaktywności krzyżowej z antygenami innych członków podrodziny Hypodermatinae, tj. Hypoderma bovis, Hypoderma tarandi, Hypoderma diana i Przhevalskiana silenus (patrz Monfray i Boulard 18 ; Boulard i wsp. 19 ) jest przydatne podczas wykonywania testu ELISA z antygenami H lineatum, nawet jeśli nie występują one endemicznie w kraju pochodzenia pacjenta.

Powtórne leczenie iwermektyną wydawało się skuteczne, ponieważ pacjent szybko stał się bezobjawowy, a liczba eozynofilów uległa normalizacji. Iwermektyna jest skuteczna w leczeniu wielu rodzajów grzybic i stanowi dobrą alternatywę, gdy chirurgiczne usunięcie jest niewykonalne. 20 Jest to ważne, ponieważ larwy Hypoderma mogą migrować w organizmie, aby zająć ośrodkowy układ nerwowy 21 lub, częściej, oczy, gdzie powodują oftalmomiozę. 22 W naszym przypadku, dwie larwy pasożyta zostały usunięte chirurgicznie. Biorąc pod uwagę fakt, że obrzęki nie posiadały otworu oddechowego oraz wielkość larw, postawiono diagnozę pierwszych instarów much (LI), gotowych do wylinki do drugich instarów (LII). Co więcej, po pierwszej i drugiej turze leczenia iwermektyną pojawiły się nowe bolesne obrzęki, prawdopodobnie spowodowane przez inne niewykryte pasożyty, i dopiero po trzeciej turze iwermektyny pacjentka stała się bezobjawowa. Chociaż przypadki myiasis u ludzi są rzadkie w Europie, jeżeli objawy wskazują na tę chorobę powinni o niej pamiętać lekarze badający imigrantów i podróżnych powracających z obszarów endemicznych, takich jak Ladakh. Podczas gdy analiza serologiczna jest przydatna w diagnostyce larw Hypoderminae wywołujących grzybicę u podróżnych nie narażonych wcześniej na zarażenie larwami, ważna jest identyfikacja molekularna. W niniejszej pracy sekwencjonowanie częściowej sekwencji mitochondrialnego genu cox1 potwierdziło, że czynnikiem sprawczym jest H sinense.

Przypadki zarażenia ludzi przez Hypoderma spp. były wcześniej opisywane, przy czym najczęściej identyfikowanymi czynnikami były H bovis i H lineatum lub H tarandi. 2,22 Doniesienia o ludzkiej myiasis związanej z H diana lub Hypoderma actaeon są wyjątkowe. 23,H sinense (Pleske 1926 24 ), przez długi czas był uważany za synonim H lineatum. 25-27 Ostatnio za pomocą metod molekularnych i morfologicznych wykazano ważność H sinense jako odrębnego gatunku zarażającego bydło i jaki w Chinach. 28 Opisano również jego endogenny cykl życiowy. 29 Jest to jednak pierwsze doniesienie o H sinense jako przyczynie hipodermozy u ludzi. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę trudności w ustaleniu prawidłowego rozpoznania tego przypadku oraz niedostateczną ilość literatury, wydaje się możliwe, że rozpoznanie mogło zostać łatwo przeoczone we wcześniejszych podobnych przypadkach. W przeciwieństwie do innych larw wywołujących grzybicę (np. Gasterophilus spp.) Hypoderma spp. mogą symulować swój rozwój larwalny (chociaż bez osiągnięcia w pełni dojrzałych trzecich stadiów) u ludzkich żywicieli, często z poważnymi konsekwencjami. Migracja przez przełyk 29 mogła być przyczyną dyskomfortu i bólu brzucha początkowo opisywanego przez pacjenta w niniejszym doniesieniu.

Choroby u ludzi wywołane przez gatunki Hypoderma często wykazują rozkład sezonowy związany z kontaktem z bydłem poprzedniej jesieni lub lata. Miller i wsp.30 wymienili trzy cechy kliniczne pomocne w rozpoznaniu zarażenia Hypoderma spp. u ludzi: (1) sezonowe występowanie, (2) przemijające, wędrujące obszary zapalenia i (3) wysoka eozynofilia. Metody serologiczne są przydatne w diagnostyce importowanych przypadków grzybicy ludzkiej u podróżnych powracających z obszarów endemicznych. Niemniej jednak wymagane jest potwierdzenie poprzez morfologiczne badanie odzyskanych larw i ich molekularną identyfikację.

Autorzy dziękują profesorowi dr Luisowi Zapatero z Universidad Complutense de Madrid za nieocenioną pomoc w morfologicznej charakterystyce wyodrębnionego fragmentu pasożyta. Podziękowania należą się również Międzynarodowemu Centrum Referencyjnemu Gnathostomiasis w Tajlandii (Uniwersytet Mahidol, Bangkok) za przeprowadzenie analizy serologicznej Gnathostoma. Praca ta była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji oraz Instituto de Salud Carlos III w ramach sieci badań nad chorobami tropikalnymi (RICET RD06/0021/0019).

Deklaracja interesów

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów do zgłoszenia.