Badane grzyby

Izolaty Escovopsioides zostały uzyskane z ogrodów grzybowych różnych gatunków mrówek podcinaczek i niepodcinaczek zebranych we wcześniejszych badaniach. Kolekcja ta obejmuje 20 izolatów uzyskanych z Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi i Trachymyrmex tucumanus, oprócz gatunku typu E. nivea uzyskanego z Acromyrmex subterraneus subterraneus (tab. 3). Ponadto, jeden dodatkowy izolat uzyskano z kolonii mrówki niepylaka Apterostigma megacephala znalezionej w Parauapebas, Pará, Brazylia (Tabela 3). Wszystkie izolaty wykazywały opisane cechy morfologiczne rodzaju Escovopsioides: hialinowe kolonie na PDA, pęcherzyki terminalne i międzywęzłowe zawierające lageniformalne fialidy, hialinowe konidia w długich łańcuchach, aleurokonidia i struktury chlamydosporopodobne.

Izolaty są przechowywane jako zawiesiny konidiów w temperaturze – 80 °C (w glicerolu 10%) i w wodzie destylowanej w temperaturze 10 °C w kolekcji Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, stan São Paulo, Brazylia. Wszystkie izolaty ożywiano z zapasów poprzez inokulację zakonserwowanych konidiów na podłoże PDA i inkubowano przez 7 dni w temperaturze 25 °C, w ciemności. Wszystkie badane izolaty uzyskano jako kultury monosporowe.

Charakterystyka molekularna Escovopsioides

Genomowe DNA ekstrahowano metodą CTAB z kultur hodowanych na agarze słodowym 2% (MA2%) przez 5 dni, w ciemności. Dla wszystkich izolatów amplifikowano geny kodujące tef1 (startery: EF6-20F i EF6A-1000R), LSU (startery: CLA-F i CLA-R) oraz ITS (startery: ITS5 i ITS4). W przypadku tef1, 1 μL rozcieńczonego genomowego DNA (1:100) wykorzystano jako matrycę do amplifikacji przy użyciu illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) w następujących warunkach: wstępny etap denaturacji w 94 °C przez 2 min, następnie 15 cykli w 94 °C przez 30 s i wstępna temperatura annealingu w 65 °C obniżająca się o 1 °C na każdy cykl i końcowe przedłużenie w 72 °C przez 1 min. Przeprowadzono drugi etap PCR: 94 °C przez 30 s, a następnie 35 cykli w 94 °C przez 30 s, 48 °C przez 30 s i końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 1 min. W przypadku ITS, 2 μl rozcieńczonego genomowego DNA (1:100) wykorzystano jako matrycę do PCR, zgodnie z warunkami opisanymi w Schoch et al.: 94 °C przez 3 min, następnie 35 cykli w 94 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 min i końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 2 min. W przypadku LSU, 2 μL rozcieńczonego genomowego DNA (1:100) wykorzystano do PCR, zgodnie z warunkami opisanymi w Augustin et al.: 95 °C przez 2 min, 40 cykli po 30 s w 95 °C, 60 s w 62 °C, 90 s w 72 °C i 5 min przedłużenia w 72 °C. Produkty PCR barwiono GelRed™ (Biotium) i wizualizowano pod UV po elektroforezie w 1% żelu agarozowym.

Amplikony oczyszczano za pomocą zestawu Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) zgodnie z protokołem producenta. Próbki analizowano w NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific), a 20 ng DNA sekwencjonowano przy użyciu BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) zgodnie z instrukcją producenta. Ze względu na wysoką zawartość GC w regionie ITS Escovopsioides, do reakcji sekwencjonowania dodawano 5% DMSO. Sekwencje forward i reverse generowane były w ABI 3500 (Life Technologies) i łączone w kontigi w BioEdit v.7.1.3 . Sekwencje wygenerowane w niniejszej pracy zostały zdeponowane w NCBI-GenBank (plik dodatkowy 1: Tabela S1).

Analiza filogenetyczna

Oprócz sekwencji wygenerowanych w niniejszej pracy, z NCBI-GenBank pobrano sekwencje gatunku typowego (E. nivea) wraz z sześcioma opisanymi gatunkami Escovopsis oraz ośmioma grzybami należącymi do Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma i Lecanicillium). W ten sposób cały zestaw danych wykorzystany w niniejszej pracy obejmował sekwencje 37 grzybów (plik dodatkowy 1: Tabela S1).

Do analizy filogenetycznej sekwencje zostały wyrównane w programie MAFFT . Sekwencje tef1, ITS i LSU poddano konkatenacji w programie Winclada v.1.00.08. Jako algorytm rekonstrukcji zastosowano wnioskowanie bayesowskie. Model substytucji nukleotydów GTR + G i GTR + I + G został wybrany odpowiednio dla tef1 i ITS/LSU za pomocą AIC w jModeltest2 z przedziałem ufności 95%. W ten sposób przeprowadzono partycjonowane niezależne analizy zbioru danych w MrBayes, każda z trzema łańcuchami ogrzewanymi i jednym łańcuchem zimnym. Próbkowanie MCMC w każdej analizie odbywało się do miliona generacji. Konwergencja ciepłych i zimnych łańcuchów występowała, gdy odchylenie standardowe częstotliwości podziału było poniżej 0.01; wtedy pierwsze 25% pokoleń było odrzucane jako burn-in.

Dual-culture experiments

Wykonaliśmy testy in vitro w celu sprawdzenia potencjału antagonistycznego Escovopsioides wobec grzyba hodowanego przez mrówki tnące. Spośród 21 izolatów Escovopsioides wyselekcjonowaliśmy 13 (tab. 3), kierując się następującymi kryteriami: i) obecność polimorfizmu w genie tef1; ii) różne gatunki mrówek towarzyszących; iii) położenie geograficzne (tj. różne miasta i miejsca zbioru). Dwa z wybranych izolatów (LESF 596 i LESF 599) były już wcześniej oceniane pod kątem ich interakcji z odmianą grzyba w badaniu Varanda-Haifig i in. Jednakże, powtórzyliśmy to badanie w celu porównania z dodatkowymi izolatami Escovopsioides.

Grzyb Leucoagaricus gongylophorus FF2006 hodowany przez gatunek mrówki Atta sexdens rubropilosa został użyty w doświadczeniach z podwójną kulturą. Szczep ten jest utrzymywany na skosach agarowych poprzez kolejne przenoszenie co 24 dni w temperaturze 25°C. Produkcja gongylidiów przez ten szczep jest sprawdzana w każdym cyklu transferowym. Grzyb ten był hodowany na podłożu PDA i inkubowany w temperaturze 25 °C przez 14 dni w ciemności. Po tym okresie fragmenty grzybni (o średnicy 8 mm) przenoszono na nowe płytki Petriego (90 × 15 mm) również zawierające PDA, w odległości 1,5 cm od brzegu. Płytki te inkubowano w temperaturze 25 °C przez 14 dni w ciemności. Następnie fragmenty grzybni (o średnicy 8 mm) Escovopsioides, inkubowane wcześniej na PDA, inokulowano w odległości 3 cm od grzyba mutualistycznego. W celu porównania wpływu Escovopsioides na wzrost grzybni kultywaru grzybowego z efektami wywoływanymi przez inne grzyby, użyliśmy jednego izolatu Escovopsis sp. (LESF 19) z ogrodów grzybowych Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brazylia). Izolat ten uzyskano poprzez inokulację małych fragmentów grzybni na płytkach PDA z dodatkiem chloramfenikolu. Płytki kontrolne były inokulowane tym samym grzybem mutualistycznym, jednakże nie inokulowano Escovopsioides ani Escovopsis. Wszystkie płytki inkubowano przez 14 dni w temperaturze 25°C, w ciemności. Każdą kombinację Escovopsioides, Escovopsis i grzyba mutualistycznego przeprowadzono na dziesięciu płytkach. Płytki eksperymentalne i kontrolne były skanowane w odstępach 0, 2, 3, 5, 7, 10 dni na skanerze HP Deskjet F2050. Obrazy zostały wykorzystane do pomiaru powierzchni wzrostu kolonii (cm2) grzyba mutualistycznego w programie ImageJ v. 1.38 .

Powierzchnie wzrostu grzybni L. gongylophorus w doświadczeniach z podwójną kulturą były analizowane przy użyciu dwukierunkowej mieszanej ANOVA, z izolatami grzybów (Escovopsioides i Escovopsis) versus kontrola jako zmienną międzyprzedmiotową i czasem (dni) jako zmienną wewnątrzprzedmiotową, uwzględniając w ten sposób powtarzalne pomiary czasu w doświadczeniach. Dane sprawdzono pod względem normalności i jednorodności wariancji, stosując odpowiednio testy Shapiro-Wilka i Levene’a. Ze względu na naruszenie tych kryteriów, w razie potrzeby, dane przekształcono za pomocą logarytmu lub pierwiastka kwadratowego. Wielokrotne porównania z różnymi grzybami strzępkowymi przeprowadzono za pomocą testu t z korektą Bonferroniego.

Dla porównania izolatów powierzchnię wzrostu grzybni L. gongylophorus w kontakcie z izolatami Escovopsioides podzielono przez średnią powierzchnię jej kontroli w 10. dniu. Dane zostały sprawdzone pod kątem normalności i jednorodności wariancji. Przeprowadzono jednoczynnikową ANOVA z powierzchnią uzyskaną w 10. dniu pomiędzy wszystkimi testowanymi grzybami, a porównania pomiędzy poszczególnymi zabiegami wykonano przy użyciu testu post-hoc Tukey-HSD. Statistical analyses were performed in R v. 2.12.1 .

Bioassays on fungus garden fragments in the absence of workers

Leucoagaricus gongylophorus is cultivated in attine ant colonies in fungus gardens. Aby określić, czy Escovopsioides może rozwijać się na grzybowisku bez ewentualnego ochronnego wpływu robotnic, przeprowadziliśmy testy biologiczne z wykorzystaniem fragmentów tego podłoża wolnych od mrówek. Fragmenty grzybni uzyskano z jednej dojrzałej i zdrowej kolonii A. sexdens rubropilosa utrzymywanej w Centrum Badań Owadów Społecznych (UNESP, Rio Claro). Fragmenty ogrodu grzybowego o objętości 2 cm3 pozbawione mrówek i czerwiu umieszczano w sterylnych szalkach Petriego z nawilżoną bawełną na brzegach (wg Elizondo-Wallace i in. ). Przed przeprowadzeniem doświadczeń płytki przechowywano przez 1 dzień w temperaturze 25 °C w celu poszukiwania mrówek, które prawdopodobnie pozostały we fragmentach.

Przygotowaliśmy 10 mL zawiesiny 0,05% Tween 80 z masą grzybni i konidiami każdego z 12 izolatów Escovopsioides (izolat LESF 591 nie był używany w tym doświadczeniu) i jednego izolatu Escovopsis używanego w doświadczeniach z podwójną kulturą. Zawiesina ta była filtrowana dwa do trzech razy zgodnie z metodą Newmeyera w celu oddzielenia konidiów od fragmentów hyfusów obecnych w zawiesinie. Następnie zawiesinę rozcieńczano do 105-2,105 konidiów mL-1 w komorze Neubauera. Mikropipetą nanoszono 100 μL zawiesiny konidiów na powierzchnię fragmentu ogrodu. W kontroli negatywnej na powierzchnię ogródka dodawano taką samą ilość jałowego 0,05% roztworu Tween 80. Płytki Petriego z ogrodem grzybowym przechowywano w temperaturze 25 °C przez okres do 10 dni, przy czym do każdego zabiegu użyto 5 płytek, a do każdej kontroli 5 płytek. Ewentualny rozwój strzępek zaszczepionych grzybów obserwowano codziennie przy użyciu stereomikroskopu (EZ4, Leica). Konidiowanie Escovopsioides na ogrodach grzybowych obserwowano pobierając fragmenty grzybni rosnącej na ogrodach, montując je w wodzie i obserwując pod mikroskopem (DM500, Leica).

Dane dotyczące wzrostu i konidiowania na ogrodach grzybowych były punktowane jako: brak wzrostu (wynik 0), wzrost obserwowany tylko w stereomikroskopie (wynik 1), wzrost makroskopowy (wynik 2) i konidiowanie (wynik 3) w ciągu 10 dni monitorowania (Dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Obserwowaliśmy konidiowanie tylko po makroskopowym wzroście grzyba na ogrodach grzybowych. Uzyskano całkowitą sumę wyników z pięciu szalek Petriego każdego dnia i przekształcono ją w procent maksymalnej możliwej sumy dla bezpośrednich porównań.

Wpływ Escovopsioides na ogrody z robotnicami

Anty robotnic odgrywają ważną rolę w obronie kolonii przed patogenami i niepożądanymi mikrobami w ogrodach grzybowych . Dlatego też przeprowadziliśmy doświadczenia mające na celu sprawdzenie wpływu robotnic w ogrodach grzybowych inokulowanych konidiami tych samych grzybów, które zostały użyte w testach biologicznych na ogrodach grzybowych bez robotnic (12 izolatów Escovopsioides i 1 izolat Escovopsis).

Biologiczne testy z użyciem kolonii mrówek królewskich są trudne ze względu na dużą liczbę kolonii, których wymagałby tego typu eksperyment. Dlatego też przeprowadziliśmy testy biologiczne z wykorzystaniem fragmentów ogrodów zawierających robotnice, aby ocenić wpływ izolatów grzybów in vivo. Mimo, że ten układ doświadczalny nie odzwierciedla tego, co występuje w naturalnych koloniach, wykazał on orientacyjne informacje na temat działań obronnych robotnic przeciwko testowanym grzybom. Próba biologiczna została zaadaptowana zgodnie z metodą Elizondo-Wallace i wsp. Użyto plastikowych pojemników z niewielką warstwą gipsu w dnie, aby uniknąć wysuszenia grzybni. W plastikowych pojemnikach umieszczono około 20 cm3 grzybni z tej samej kolonii, którą wykorzystano w poprzednim eksperymencie. Zestaw doświadczalny składał się w sumie z 84 pojemników, tak że zabiegi z konidiami 13 grzybów i kontrola miały po sześć pojemników. Do doświadczenia wybrano robotnice o średnicy kapsuły głowowej od 1,0 do 1,6 mm, po 50 sztuk w każdym pojemniku. Robotnice o średnicy mniejszej niż 1,0 mm nie były liczone, a robotnice o średnicy większej niż 1,6 mm były wykluczane. Procedura ta została przyjęta w celu zapewnienia jednorodności pomiędzy sześcioma pojemnikami z każdego zabiegu, jak również pomiędzy zabiegami, ponieważ robotnice w przedziale pomiędzy 1,0 a 1,6 mm wykazują znaczącą aktywność czyszczącą. Wewnętrzna powierzchnia pojemnika została pokryta Teflonem®, aby zapobiec ucieczce mrówek.

Pojemniki inkubowano w temperaturze 25 °C przez 3 dni w celu ustabilizowania ogrodów grzybowych. Zawiesiny konidiów otrzymywano w sposób opisany powyżej. Łącznie 1 mL zawiesiny konidiów rozpylano na powierzchni ogródków grzybowych za pomocą opryskiwacza. Ogródki grzybowe w kontroli negatywnej opryskiwano tylko 1 mL sterylnego 0,05% roztworu Tween 80.

Doświadczenia monitorowano po 0, 5 i 10 dniach od inokulacji w celu sprawdzenia zdrowotności ogródków grzybowych. Parametr ten był oparty na systemie punktacji, w którym zdrowe ogrody otrzymywały ocenę 0, częściowo zdegradowane ogrody otrzymywały ocenę 1, a całkowicie zdegradowane („zainfekowane”) ogrody otrzymywały ocenę 2. Mrówcze usuwanie kawałków zagrzybionych ogrodów i umieszczanie ich na wysypiskach śmieci było główną oznaką degradacji ogrodów, którą badaliśmy (patrz plik dodatkowy 1: Rysunek S2). Oceny uzyskane z sześciu pojemników każdego eksperymentu, w ciągu 3 dni obserwacji, porównano przy użyciu testu Friedmana.

Aby sprawdzić obecność izolatów Escovopsioides na ogrodach grzybowych w dniach 0, 5 i 10 po leczeniu, fragmenty usunięto z ogrodów i zaszczepiono na MA2% uzupełnionym 150 μg mL- 1 chloramfenikolu. Płytki inkubowano w temperaturze 25°C przez 7 dni, w ciemności. Pięć płytek z jednym fragmentem ogrodu wykorzystano do każdego z sześciu pojemników z każdego traktowania, w sumie 30 płytek na traktowanie. Fragmenty z pozytywnym wzrostem zostały policzone, a długoterminowa obecność zaszczepionych grzybów w ogrodach grzybowych została sprawdzona przy użyciu testu Fishera’s Exact. W tej analizie porównano proporcję frangmentów zainfekowanych konidiami grzybów (Escovopsioides i Escovopsis) w stosunku do kontroli bez konidiów w każdym dniu doświadczenia. Porównaliśmy również różne zabiegi z inokulowanymi grzybami między sobą w każdym dniu doświadczenia.