HypaCas9 and Cas9-HF1 show slow observed rates of cleavage

Nasze analizy kinetyczne rozpoczynamy od pomiaru stężenia miejsca aktywnego enzymu dla każdego z wariantów Cas923,24,25. Pomiar ilości produktu utworzonego w miareczkowaniu enzymu z rosnącym stężeniem DNA ujawnił stężenie miejsca aktywnego 31 nM, 26 nM, 23 nM odpowiednio dla SpCas9, HypaCas9 i Cas9-HF1, dla próbek enzymu o nominalnym stężeniu 100 nM w oparciu o absorbancję przy 280 nm (Supplementary Fig. 1a-d). Zmierzyliśmy również stężenia w miejscu aktywnym SpCas9 i HiFiCas925 z Integrated DNA Technologies (IDT) i zaobserwowaliśmy podobne stężenia aktywnego enzymu (Supplementary Fig. 1e-f). Ważne jest, aby zauważyć, że w każdym przypadku stężenie DNA wymagane do nasycenia sygnału było równe stężeniu utworzonego produktu, co eliminuje obawy, że część enzymu może wiązać DNA, ale nie reagować. Wszystkie późniejsze eksperymenty zostały ustawione przy użyciu stężenia aktywnego enzymu określonego w miareczkowaniu miejsca aktywnego.

Aby porównać kinetykę substratów DNA on- lub off-target SpCas9 z wariantami inżynieryjnymi, najpierw zbadaliśmy przebieg czasowy rozszczepienia nici docelowej (HNH) dla każdego enzymu (ryc. 1 i uzupełniająca ryc. 2). Dane dopasowywano do funkcji jedno- lub dwuwykładniczej, stosując odpowiednio Eq. (1) lub Eq. (2).

gdzie Y reprezentuje stężenie produktu rozszczepienia, A1 reprezentuje amplitudę, a λ1 reprezentuje obserwowaną szybkość rozpadu (wartość własna)17.

gdzie Y reprezentuje stężenie produktu rozszczepienia, A1 reprezentuje amplitudę, a λ1 reprezentuje obserwowaną szybkość dla pierwszej fazy. A2 reprezentuje amplitudę, a λ2 reprezentuje obserwowaną szybkość dla drugiej fazy.

Porównanie obserwowanych szybkości rozpadu substratów on- i off-target przez SpCas9 pokazuje, że niedopasowanie PAM-dystalne 3 bp spowalnia enzym 13-krotnie (z 1 s-1 do 0,076 s-1). Oba warianty Cas9 o wysokiej wierności drastycznie zmniejszają obserwowaną szybkość rozpadu substratów DNA 21- do 35-krotnie w porównaniu do SpCas9 (0,028 s-1 dla HypaCas9 i 0,047 s-1 dla Cas9-HF1 vs 1 s-1 dla SpCas9). Co więcej, HypaCas9 i Cas9-HF1 zmniejszają szybkość rozpadu poza docelowym DNA od 8 do 290 razy (odpowiednio 0,0033 s-1 i 0,00016 s-1) w stosunku do szybkości rozpadu z docelowym DNA. Dane te pokazują drastyczne zmiany w obserwowanych szybkościach rozszczepiania przez zmodyfikowane warianty z DNA docelowym i pozatargetowym. Jednak same te pomiary nie definiują zmian w specyficzności, która jest funkcją kinetycznego podziału rozszczepienia DNA w stosunku do dysocjacji, obejmującego wszystkie etapy prowadzące do pierwszego nieodwracalnego kroku w szlaku17, w tym odwracalne wiązanie DNA, tworzenie pętli R, dokowanie domeny HNH i rozszczepienie DNA.

Odwijanie DNA jest w dużej mierze niezmienione w wariantach Cas9

Ponieważ nasza poprzednia praca zidentyfikowała tworzenie pętli R jako tempo ograniczające dla docelowego rozszczepienia, a inni później zasugerowali, że tempo tworzenia pętli R i ponownego zwijania może dyktować specyficzność enzymu dla SpCas9 i Cas9-HF116, sprawdziliśmy, czy HypaCas9 wykaże podobną kinetykę. Aby bezpośrednio zmierzyć szybkość tworzenia pętli R dla wszystkich enzymów, zastosowaliśmy analizę przepływu zatrzymanego opartą na pomiarze fluorescencji tCo przy -16 nt, fluorescencyjnego trójcyklicznego analogu cytozyny, który jest wygaszany przez układanie zasad w dsDNA, tak że otwarcie dupleksu powoduje duży wzrost fluorescencji. Nasze eksperymenty kontrolne z użyciem analogów zasadowych znakowanych tCo i 2-AP w pozycjach -16, -9 i -1 nt, odpowiednio (Supplementary Fig. 3), pokazują, że żaden z analogów nie wpływa na obserwowaną szybkość zanikania rozszczepiania DNA. Struktury chemiczne tCo i 2AP są znacznie mniej nieporęczne niż większe etykiety Cy3 i Cy5 i mniej prawdopodobne jest, że będą zakłócać kinetykę enzymatyczną (Supplementary Fig. 4). W obecności Mg2+, SpCas9, HypaCas9 i Cas9-HF1 odwijają docelowy substrat DNA z niemal identyczną szybkością rozpadu (~2 s-1) (Rys. 2). Co zaskakujące, tempo zaniku tworzenia pętli R dla substratów DNA poza celem dla wszystkich wariantów Cas9 było również w dużej mierze niezmienne (pomiędzy 0,85 s-1 a 2,59 s-1). Zatem odwijanie DNA nie jest ograniczające i nie jest skorelowane z obserwowaną szybkością rozszczepiania dla wariantów o wysokiej wierności, w przeciwieństwie do SpCas9.

Zważywszy na lokalizację tCo przy -16 nt, jest prawdopodobne, że nasze pomiary odzwierciedlały etap późny w procesie odwijania. Dla porównania, zmierzyliśmy szybkość rozpadu dla tworzenia pętli R używając tCo znakowanego w pozycji bezpośrednio bliższej PAM (pozycja -1 nt). Po szybkim wymieszaniu Cas9-RNA z docelowym substratem DNA, zaobserwowaliśmy wyraźny wzrost fluorescencji w miarę jak DNA odwija analog zasadowy tCo. Dopasowaliśmy dane do podwójnego wykładnika, aby określić główną szybkość rozpadu 10 s-1 (Rys. 3a-f). Intrygująco, wyniki te wskazują, że gdy miejsce PAM jest zaangażowane przez enzym, początkowe odwijanie DNA jest szybsze niż obserwowane przy -16 nt. Dane te sugerują, że obserwowane netto tempo zanikania odwijania obserwowane przy -16 nt może być funkcją kilku szybkich kroków odwijania prowadzących do całkowitego odwijania. Ponieważ jednak w kinetyce nie zaobserwowano opóźnienia, wydaje się, że szybsze, wcześniejsze etapy częściowego odwijania prowadzą do końcowego etapu ograniczającego szybkość pełnego odwijania, mierzonego w pozycji -16 nt. Chociaż potrzebne są dalsze badania w celu sprawdzenia wpływu niedopasowań na wcześniejszych etapach odwijania, nasze obecne pomiary zapewniają najlepsze oszacowanie szybkości netto tworzenia pętli R. Szybkość zaniku mierzona dla tworzenia pętli R przy użyciu tej etykiety jest nie do odróżnienia zarówno dla SpCas9 jak i wariantów o wysokiej wierności na wszystkich badanych substratach, więc szybkość odwijania DNA wydaje się być niezmieniona przez zmodyfikowane enzymy Cas9.

Aby skorelować szybkość tworzenia pętli R z etapami związanymi z dokowaniem domeny HNH do nici docelowej, zmierzyliśmy zmiany konformacyjne enzymu za pomocą analizy zatrzymanego przepływu na Cas9, który był znakowany Cy3 i Cy5, jak opisano wcześniej18. W skrócie, cysteinowa wersja Cas9 została wyznakowana Cy3 przy aminokwasie 355 i Cy5 przy aminokwasie 867. Wydajność FRET wzrasta, gdy domena HNH rearanżuje się do stanu katalitycznie aktywnego (Rys. 3g). Po szybkim wymieszaniu Cas9 znakowanego parami FRET z idealnie dopasowanym docelowym DNA, zaobserwowaliśmy wzrost wydajności FRET, wskazujący na rearanżację domeny HNH do stanu katalitycznie aktywnego. Zmierzyliśmy szybkość zanikania dokowania HNH jako ~2,5 s-1 (Rys. 3h), co jest podobne do pomiarów FRET dla pojedynczych cząsteczek. Zaskakująco, obserwowane szybkości tworzenia pętli R (1,5 s-1) i dokowania domeny HNH są bardzo podobne, co wskazuje, że te etapy mogą być kinetycznie powiązane. Nieco szybsze obserwowane tempo zaniku dla ruchu domeny HNH może być spowodowane reakcją odwrotną, ponieważ ruch domeny dochodzi do równowagi po lub zbieżnie z tworzeniem pętli R.

Szybkości zaniku odwijania DNA były również mierzone metodami jednocząsteczkowymi przy użyciu DNA znakowanego parą FRET, Cy3 i Cy5 były znakowane odpowiednio w pozycji -6 nt na nici docelowej i -16 nt na nici nie docelowej16. Dlatego przetestowaliśmy również sparowane FRET substraty DNA, próbując skorelować sygnał FRET z obserwowanymi szybkościami rozszczepiania DNA. Po pierwsze, przetestowaliśmy substrat używany wcześniej w badaniach jednocząsteczkowych bez etykiet Cy3/Cy516, który różni się od naszego substratu dwoma nukleotydami, a konkretnie substytucją T w pozycjach -16 i -18. Szybkość rozpadu nici docelowej (HNH) jest podobna jak w przypadku naszego substratu (0.7 s-1 vs 1 s-1, Supplementary Fig. 5a), więc kontekst sekwencji w tej pozycji nie ma znaczącego wpływu. Testowaliśmy również rozszczepianie DNA znakowanego Cy3/Cy5 tą inną sekwencją i wykazywała ona podobną szybkość rozpadu jak nasza sekwencja (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, Rys. 5b i 6a). Następnie zbadaliśmy przebieg czasowy rozszczepienia nici docelowej (HNH) DNA znakowanego Cy3/Cy5 z naszą sekwencją dla każdego enzymu (Rys. 6). W przypadku SpCas9 reakcja DNA znakowanego Cy3/Cy5 przebiega w sposób pojedynczy wykładniczy z wyraźnie zmniejszoną szybkością rozpadu (0,06 s-1 vs 1 s-1), co wskazuje na ~17-krotny spadek obserwowanej szybkości rozpadu DNA w porównaniu do nieznakowanego substratu. Zmodyfikowane HypaCas9 i Cas9-HF1 również wykazywały zmniejszoną szybkość rozpadu DNA odpowiednio o 0,0046 s-1 i 0,0016 s-1, co jest odpowiednio 5,9-krotnie i 28,75-krotnie wolniejsze niż w przypadku nieznakowanych substratów mierzonych w identycznych warunkach. Wyraźnie widać, że interferencja etykiet Cy3/Cy5 zmienia wpływ wariantów o wysokiej wierności na szybkość rozszczepiania DNA. W sumie, znakowanie DNA nieporęcznymi etykietami Cy3 i Cy5 dramatycznie wpłynęło na działanie enzymu. Z tych powodów nie przeprowadzono dalszych badań z użyciem DNA znakowanego parami FRET.

Swoistość Cas9 jest regulowana przez podział kinetyczny

Ponieważ swoistość enzymu jest funkcją wszystkich kroków prowadzących do pierwszego, w dużej mierze nieodwracalnego kroku, wszystkie zdarzenia poprzedzające rozszczepienie DNA muszą być brane pod uwagę17. Aby zmierzyć wewnętrzną szybkość rozszczepiania, ominęliśmy normalnie ograniczający szybkość etap tworzenia pętli R przez preinkubację SpCas9 z docelowym DNA w nieobecności Mg2+, aby umożliwić wiązanie i zmiany konformacyjne do osiągnięcia równowagi w celu utworzenia kompleksu SpCas9.DNA. Następnie zainicjowaliśmy reakcję chemiczną przez dodanie 10 mM Mg2+. W naszych poprzednich badaniach, tworzenie pętli R było ograniczone szybkością reakcji SpCas9 z docelowym DNA, a wewnętrzna szybkość rozpadu była szybsza, gdy była mierzona przy użyciu protokołu preinkubacji. W przypadku DNA poza celem, szybkość rozszczepiania HNH i RuvC wynosiła odpowiednio 0,12 s-1 i 0,14 s-1 (Suplementarne ryc. 7c, d i Suplementarne ryc. 8), co jest znacznie wolniejsze od szybkości tworzenia pętli R. Co intrygujące, wyniki te wskazują, że etapem ograniczającym tempo w szlaku enzymatycznym SpCas9 z off-target jest rozszczepienie DNA, ponieważ zmierzona przez nas szybkość rozpadu dla tworzenia pętli R wynosiła 0,85 s-1 (Rys. 2b). Dane te wskazują, że dyskryminacja opiera się, przynajmniej częściowo, na zmianie tożsamości kroku ograniczającego szybkość w porównywaniu DNA on- i off-target.

Powtórzyliśmy te eksperymenty z HypaCas9 i Cas9-HF1 z DNA on- lub off-target. Wyniki te określają obserwowane szybkości rozszczepiania HNH na poziomie 0,035 s-1 i 0,0023 s-1 dla HypaCas9 z substratami on- i off-target, odpowiednio (Supplementary Fig. 7g, k). Zaobserwowane szybkości rozszczepiania Cas9-HF1 dla substratów on- i off-target wynosiły odpowiednio 0,038 s-1 i 0,00014 s-1 (Supplementary Fig. 7o, q). Te zaobserwowane szybkości rozpadu są nieco szybsze niż te zmierzone przy jednoczesnym dodaniu DNA i Mg2+, co wskazuje, że jakiś krok inny niż tworzenie pętli R, ale poprzedzający rozszczepienie DNA, może spowalniać obserwowaną szybkość rozpadu. Niemniej jednak, wyniki te pokazują, że obserwowane szybkości rozszczepiania docelowego DNA są zmniejszone ~100-krotnie zarówno dla HypaCas9 jak i Cas9-HF1 w stosunku do SpCas9. W przypadku nie docelowego DNA, obserwowane szybkości rozszczepiania są zredukowane 50- lub 860-krotnie dla HypaCas9 lub Cas9-HF1, odpowiednio, w stosunku do SpCas9.

Dyskryminacja nie jest definiowana wyłącznie przez względne szybkości rozszczepiania DNA. Ponieważ tworzenie pętli R jest szybkie, dyskryminacja jest raczej funkcją podziału kinetycznego między szybkością uwalniania DNA a szybkością rozszczepiania17,26,27. W celu ilościowego określenia podziału kinetycznego, inkubowaliśmy enzym i znakowane DNA pod nieobecność Mg2+, co pozwala na osiągnięcie równowagi w tworzeniu pętli R, ale uniemożliwia katalizę15. Następnie dodawaliśmy Mg2+ w celu zainicjowania reakcji w obecności dużego nadmiaru identycznego, nieoznakowanego docelowego DNA, służącego jako pułapka. Porównanie równoległych eksperymentów przeprowadzonych w obecności i bez pułapki DNA pozwala na oszacowanie frakcyjnego podziału kinetycznego dla dysocjacji w stosunku do rozszczepienia związanego DNA (Rys. 4a). Po związaniu SpCas9 z docelowym DNA, został on szybko rozszczepiony, a pułapka DNA miała niewielki wpływ (Rys. 4b). W przeciwieństwie do tego, 33% DNA poza celem odłączało się od enzymu, podczas gdy ~67% DNA było zaangażowane w rozszczepianie (Rys. 4c i Supplementary Fig. 9a). Wyniki te pokazują, że SpCas9 dyskryminuje niedopasowane PAM-dystalne DNA poprzez zmniejszenie szybkości rozszczepiania, co zwiększa frakcję DNA, która jest raczej uwalniana niż rozszczepiana. Jednak efekt jest niewielki, więc tempo dysocjacji wydaje się być wolniejsze niż rozszczepianie.

Następnie zbadaliśmy podział kinetyczny dla HypaCas9 i Cas9-HF1 związanego z docelowym DNA (Rys. 4d, f, Uzupełniające Rys. 9b, d). Nasze wyniki z HypaCas9 i Cas9-HF1 pokazują, że odpowiednio ~75% i ~92% docelowego DNA zostało rozszczepione w obecności pułapki. Odsetek rozszczepionego DNA jest mniejszy niż dla SpCas9 typu dzikiego, ponieważ obserwowane wewnętrzne tempo rozpadu docelowego DNA przez HypaCas9 (0,035 s-1) i Cas9-HF1 (0,038 s-1) było 100-krotnie wolniejsze niż w przypadku SpCas9 (4,3 s-1). To wolniejsze tempo rozszczepiania daje czas dla małej frakcji (8 do 25%) docelowego DNA na dysocjację zanim zostanie rozszczepione.

Kinetyczny podział na korzyść dysocjacji został wzmocniony, gdy HypaCas9 i Cas9-HF1 reagują z pozacelowym DNA, ponieważ tempo rozszczepiania zostało jeszcze bardziej zredukowane do odpowiednio 0,0023 s-1 i 0,00014 s-1 (Rys. 4e, g, Uzupełniające Rys. 9c, e). Szybkości te są od 50 do 860 razy wolniejsze, odpowiednio, w porównaniu do SpCas9 na substracie pozatargetowym. W związku z tym, tylko ~24% i ~10% związanego pozatargetowego DNA zostało przeznaczone do rozszczepienia przez HypaCas9 i Cas9-HF1, odpowiednio, w obecności DNA pułapkowego. Łącznie, wyniki te pokazują, że zmodyfikowane warianty o wysokiej wierności uzyskały lepszą specyficzność wobec niedopasowanego PAM-dystalnego DNA poprzez wyraźnie zmniejszoną szybkość rozszczepiania, co zmienia podział kinetyczny na korzyść uwalniania, a nie rozszczepiania związanego substratu zarówno dla DNA docelowego, jak i pozacelowego, ale efekt ten jest większy dla DNA pozacelowego. Obliczenie stałych szybkości pozornej dysocjacji przy użyciu równania (3) pokazuje, że warianty o wysokiej wierności nie zwiększają pozornej szybkości uwalniania DNA (Tabela uzupełniająca 1).

Raczej, zwiększona dyskryminacja jest w całości przypisywana spadkom pozornej stałej szybkości rozszczepiania.

W naszych dotychczasowych opisach kinetyki enzymów Cas9, obserwowane szybkości rozpadu reakcji były szacowane w oparciu o dopasowanie danych do funkcji wykładniczych, które dają wartości własne będące zwykle złożonymi funkcjami wielu stałych szybkości17. Aby w pełni zrozumieć kinetykę i mechanizm, wszystkie eksperymenty dla każdego enzymu i substratu DNA zostały dopasowane globalnie w oparciu o numeryczną integrację równań szybkości reakcji przy użyciu jednego zunifikowanego modelu (Rys. 5 i Rys. uzupełniające 10-14). Globalne dopasowanie danych pokazuje, że nasz minimalny model (Rys. 5f, wstawka) uwzględnia nasze dane, a każda ze stałych szybkości jest dobrze zdefiniowana na podstawie analizy konturu ufności testującej zakres, w jakim każdy parametr jest ograniczony przez dane (Rys. 6)17,28. W szczególności należy zauważyć, że nasz model uwzględnia dwufazowe ślady obserwowane w niektórych eksperymentach bez konieczności odwoływania się do heterogeniczności i zapewnia wewnętrzne stałe szybkości dla każdego kroku w ścieżce, w tym tworzenia pętli R oraz zdarzeń rozszczepiania HNH i RuvC. Chociaż jest prawdopodobne, że dodatkowe, nierozstrzygnięte rearanżacje strukturalne mogą być wymagane do wyrównania reszt katalitycznych w celu rozszczepienia DNA, nie zostały one jeszcze rozstrzygnięte jako kinetycznie odrębne zdarzenia. Obecny model reprezentuje minimalną ścieżkę niezbędną i wystarczającą do uwzględnienia wszystkich dostępnych danych i może być łatwo rozszerzony, gdy nowe informacje staną się dostępne w celu zdefiniowania dodatkowych etapów ścieżki.

Aby zrozumieć specyficzność enzymu, stałe szybkości muszą być interpretowane w kontekście wszystkich kinetycznie istotnych etapów, jak pokazano w profilu energii swobodnej (obliczonej przy użyciu Eq. (4) ze stałych szybkości w Tabeli 1).

Współczynnik transmisji A = 0.001

Ponieważ globalne dopasowanie danych dostarcza stałych szybkości dla każdego istotnego kroku (Rys. 5 i 6), możemy skonstruować bona fide profil energii swobodnej (Rys. 7b, i Uzupełniające Rys. 10-14). Profile energii swobodnej porównujące SpCas9, HypaCas9 i Cas9-HF1 wykazują zmiany w etapach limitujących tempo i determinujących specyficzność. Specyficzność enzymu jest definiowana przez kcat/Km i jest określona przez najwyższą ogólną barierę w stosunku do stanu wyjściowego, podczas gdy maksymalna szybkość, kcat, jest określona przez najwyższą lokalną barierę w stosunku do stanu poprzedzającego, osłabioną przez jakiekolwiek poprzedzające etapy szybkiej równowagi. Ponieważ stałe szybkości tworzenia pętli R nie zmieniają się znacząco przy różnych substratach i wariantach enzymu, specyficzność jest regulowana w dużej mierze przez kinetyczny podział pętli R Cas9, stanu EDH w naszym modelu kinetycznym (Rys. 5f, wstawka), aby albo iść do przodu, powodując nieodwracalne rozszczepienie, albo uwolnienie poprzez ponowne wyżarzanie DNA i wyrzucenie z enzymu. Wyższe ogólne bariery rozszczepienia obserwowane w przypadku wariantów o wysokiej wierności zwiększają prawdopodobieństwo podziału kinetycznego na korzyść dysocjacji DNA (Rys. 6c).