Proste niezrównoważone translokacje i inwersje (klasy A i C): mechanizmy pochodzenia
Prostym wynikiem tego badania jest to, że w 20 z 37 niezrównoważonych translokacji de novo, duplikacja ma pochodzenie matczyne (Ryc. 1, Zasób Online 1: Tabela S2). Ponieważ badanie pochodzenia rodzicielskiego nie było informatywne lub nie było możliwe w sześciu przypadkach (przypadki 7, 14, 23, 24, 33 i 35), niezrównoważone translokacje de novo, w których zduplikowany region jest pochodzenia matczynego, stanowią 64,5% (20/31) w pełni informacyjnych przypadków. Łącząc te dane z ustaleniem, że w ośmiu z tych przypadków (przypadki 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 i 32) trzy allele (Fig. 1, Online Resource 1: Tabela S2), dwa matczyne i jeden ojcowski, były obecne przynajmniej w części regionu duplikacji, wyłaniający się scenariusz jest taki, że w nie mniej niż 25% (8 z 31), głównym czynnikiem powodującym występowanie de novo niezrównoważonych translokacji jest matczyna dysjunkcja mejotyczna, a następnie częściowa trisomia ratunkowa supernumerarnego chromosomu matczynego (ryc. 1a). Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem obecności trzech alleli w obrębie zduplikowanego regionu, dwóch matczynych i jednego ojcowskiego, jest brak dysjunkcji w mejozie matczynej I (mat-MI) (ryc. 1A.I). Alternatywnie, rekombinacja mejotyczna proksymalnie do lub w punkcie przerwania translokacji musiała poprzedzić brak dysjunkcji w matczynej mejozie II (mat-MII). Z kolei w 12 przypadkach (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 i 37) z tym samym matczynym zduplikowanym haplotypem nie można wykluczyć innych mechanizmów (ryc. 1b), choć mogły one również wynikać albo z niedysjunkcji mat-MI (ryc. 1A.I), po telomerycznym crossing-over, zgodnie z preferencyjnym występowaniem telomerycznych crossoverów wykazanych dla niektórych niedysjunkcyjnych chromosomów (Oliver i in. 2014) lub matczynej niedysjunkcji MII (mat-MII) (Ryc. 1A.II), jak donoszono w wielu przypadkach ratowania trisomii (przegląd w Chantot-Bastaraud i wsp. 2017).
Dobrze wiadomo, że anafazowe opóźnienie chromosomu supernumerarnego, po którym następuje jego uwięzienie w obrębie mikronukleusa, leży u podstaw wielu zdarzeń chromotrypsji (Zhang i wsp. 2015; Ly i wsp. 2017; Zhu i wsp. 2018). W konsekwencji w jednej komórce potomnej supernumerarny chromosom zostaje wyeliminowany, natomiast w drugiej roztrzaskanie mikrojądrowego materiału genomowego, a następnie ponowne osadzenie wszystkich lub niektórych fragmentów wewnątrz jądra głównego może skutkować masywną reorganizacją pierwotnego chromosomu, który albo zachowuje większość swojego materiału, choć zreorganizowanego w nowym porządku, albo traci niektóre jego porcje (Rys. 1a), to, które fragmenty oryginalnego supernumerarnego chromosomu zostaj± utracone, a które zachowane, może zależeć od zdarzeń stochastycznych, od skłonno¶ci odłamanych końców do integrowania się ze sob± lub z innymi czę¶ciami genomu, i/lub od następczej selekcji komórek, które mog± przetrwać i rozmnażać się w obecno¶ci minimalnej nierównowagi segmentalnej. W teorii, centryczne fragmenty mogą zostać zachowane jako supernumerarne chromosomy markerowe przez ich kolonizację z tworzeniem chromosomów pierścieniowych, przezwyciężając w ten sposób brak sekwencji telomerowej na obu końcach. Zachowanie supernumerarnych międzywęzłowych fragmentów acentrycznych wymaga również utworzenia neocentromeru lub, alternatywnie, przechwycenia fragmentu przez inny chromosom z utworzeniem translokacji insercyjnej de novo. Rzeczywiście, Kato i wsp. (Kato i wsp. 2017) donieśli ostatnio o przypadku translokacji międzywęzłowej de novo pochodzącej z chromotrypsji supernumerarnego chromosomu obecnego w trisomicznej zygocie. Wreszcie, zachowanie fragmentów supernumerarnych wyposażonych w telomery na jednym końcu wymaga albo przechwycenia telomerów, np. translokowanego supernumerarnego chromosomu markerowego, jak podali Vetro i wsp. (2012) (przypadki 2 i 3), albo przechwycenia go przez inny chromosom, biorcę, który traci swoją dystalną część, tworząc w ten sposób 46-chromosomową komórkę z niezrównoważoną translokacją de novo, jak opisano tutaj. Rzeczywiście, przypadek 6 z duplikacją tego samego haplotypu matczynego (Ryc. 1, Zasoby Online 1: Tabela S2) ilustruje wystąpienie zdarzenia chromotrypsji (Ryc. 1a), jak pokazano przez obecność dwóch niekontrastujących się zduplikowanych regionów oddzielonych ~ 1,3 Mb, z których jeden międzywęzłowy ma odwróconą orientację (Zasoby Online 2: Figura S15). Zdarzenia chromotrypsji zaobserwowano w wielu przypadkach de novo niezrównoważonych translokacji (Weckselblatt i wsp. 2015), a większość z nich została zgłoszona jako pochodzenia ojcowskiego i obejmująca więcej niż dwa chromosomy (Marcozzi i wsp. 2018). W przeciwieństwie do tego, niezrównoważona translokacja w naszym przypadku 6 była pochodzenia matczynego i rzeczywiście de novo, w zgodzie z badaniami FISH metafaz rodzicielskich. Ponadto, przynajmniej jak oceniono na podstawie badań aCGH i FISH o wysokiej rozdzielczości (1M), obejmowała ona tylko dwa chromosomy, podczas gdy bardziej złożona rearanżacja została wykluczona. Dlatego kuszące jest spekulowanie, że zygota lub wczesny zarodek były trisomiczne dla chromosomu 8 z powodu mejotycznej lub postzygotycznej dysjunkcji matczynej. Po rozbiciu supernumerarnego chromosomu 8 nastąpiło odzyskanie tylko dwóch niestykających się fragmentów, w tym telomerycznego, które, gdy już zszyte z powrotem, zostały nabyte przez biorcę 18q (ryc. 1a).
Model powstawania de novo niezrównoważonych translokacji, począwszy od trisomicznej zygoty, pasuje również do przypadku 24, chociaż nie mogliśmy przeprowadzić żadnych wspierających badań molekularnych. Jednakże obecność szczątkowej linii komórkowej trisomicznej dla chromosomu 9, wraz z główną z normalnym kariotypem i trzecią z niezrównoważoną translokacją t(14;9) sugeruje, jak, począwszy od trisomicznej zygoty, mogą powstawać różne linie komórkowe, niektóre z całkowitą utratą nadliczbowego chromosomu, a inne z utratą jego części (9p) i jego szczątkowej części (cały 9q) przechwyconej przez inny chromosom. Tego typu mozaiki trzech linii komórkowych były rzadko dokumentowane (Phillips i wsp. 1997), ale w diagnostyce prenatalnej mozaiki z jedną prawidłową linią komórkową i drugą z niezrównoważoną translokacją de novo są stosunkowo częste i w większości z nich można wykryć podwyższony wiek ciążowy (Kovaleva i Cotter 2017; Van Opstal i wsp. 2018).
An independent support for the hypothesis that maternal non-disjunction is a main trigger for de novo unbalanced translocations, is an increased maternal age. Rzeczywiście, w naszych ośmiu przypadkach (przypadki 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 i 32), w których duplikacja była bez wątpienia związana z matczyną dysjunkcją mejotyczną (dwa różne allele matczyne w regionie duplikacji), wzrost średniego wieku matki został udokumentowany (34,75 lat, Zasób Online 1: Tabela S1), biorąc pod uwagę, że średni wiek matki we Włoszech w 2016 roku wynosił 31,8 lat (ISTAT, https://www.istat.it/). Wzrost (33,5 roku) został również rozpoznany w 12 przypadkach (przypadki 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 i 37) z duplikacją tego samego allelu matczynego, zgodnego z matczyną niedysjunkcją jako zdarzeniem inicjującym. Nawet w przypadkach, gdzie duplikacja była ojcowska, wzrost, choć znacznie bardziej ograniczone, wykazano w średnim wieku matki (32,6 lat), być może wskazując, że mechanizmy inne niż matczynej non-disjunction może odgrywać rolę w tworzeniu tych niezrównoważonych translokacji. Rzeczywiście, w czterech przypadkach (3, 8, 29 i 36) analizowanych przez SNP array żadna matczyna heteroizodisomia nie była obecna w nieduplikowanej części chromosomów homologicznych (Zasób Online 1: Tabela S2), jak można by się spodziewać dla trisomicznej zygoty, w której supernumerarny chromosom ojcowski przeszedł chromotrypsję z ocaleniem tylko części telomerycznej. Tak więc, biorąc również pod uwagę znikomą częstość trisomii pochodzących z missegregacji w mejozie ojcowskiej (Nagaoka i wsp. 2012), wystąpienie niezrównoważonych translokacji zapoczątkowanych częściowym ratowaniem trisomicznej zygoty ojcowskiej pochodzenia wydaje się wysoce nieprawdopodobne. Zamiast tego inne mechanizmy, takie jak odziedziczone lub postzygotyczne dwuniciowe pęknięcie ojcowskie wymagające naprawy przez wychwyt telomerów, wydają się bardziej prawdopodobne (Ryc. 1b). Rzeczywiście, przypadek 25, który jest mozaikowy dla dwóch linii komórkowych, obecnych we krwi i w fibroblastach, z terminalną delecją 2q i pochodnym chromosomem der(2)t(2q;14q) pochodzenia ojcowskiego (Online Resource 2:Figure S9), pasuje do tej hipotezy. Tak więc, w obecności terminalnej delecji, różne mechanizmy naprawcze mogą wystąpić w różnym czasie w różnych komórkach wczesnego zarodka, ostatecznie prowadząc do stanu mozaikowego. W tym modelu usunięty chromosom inicjuje wydarzenie translokacji, działając jako biorca, podczas gdy zduplikowany jest dawcą, działającym jako naprawiający uszkodzenie (ryc. 1b). Nie można jednak stwierdzić, czy delecja jest rzeczywiście pierwszym zdarzeniem prowadzącym do translokacji, czy też jest wtórna do powstania chromosomu dicentrycznego (Ryc. 1BIII i IV), który w wyniku swojego asymetrycznego pęknięcia generuje chromosom inv-dup del i chromosom po prostu skasowany, ten ostatni jest następnie naprawiany przez wychwyt telomerów (Ryc. 1b). Możliwe jest, że utrzymywanie się dicentryczności poza pierwszymi podziałami embrionalnymi skutkuje pęknięciami o różnej wielkości w różnych komórkach, ponownie naprawianymi przez telomerazę lub wychwyt telomerów.
Remarkabalnie, niezależnie od mechanizmu, wykryto wysoką przewagę przypadków, w których oba zaburzenia równowagi mają to samo pochodzenie rodzicielskie (Ryc. 1, Zasób Online 1: Tabela S2), mimo że w połowie przypadków spodziewano się dwurodzicielskiego pochodzenia delecji i duplikacji, zgodnie z końcowym zdarzeniem postzygotycznym. Wykazanie wyraźnej kompartmentalizacji dwóch zestawów chromosomów rodzicielskich w embrionach myszy do stadium 8-komórkowego (Du i wsp. 2017) może dostarczyć wyjaśnienia. Ponieważ okres ten zbiega się z bardzo wysoką niestabilnością chromosomalną, (McCoy i wsp. 2017), kuszące jest spekulowanie, że mechanizm taki jak wychwytywanie telomerów, niezbędny do stabilizacji wcześniejszej nieprawidłowości strukturalnej, zachodzi na tym samym zestawie chromosomów rodzicielskich pierwotnej anomalii. W przeciwieństwie do tego, oczekuje się, że dalsze późniejsze readaptacje wystąpią losowo, obejmując chromosomy obu rodzicielskich pochodzeń, co doprowadziłoby do niezrównoważonego translokowanego chromosomu pochodzenia dwurodzicielskiego, jak rzeczywiście znaleźliśmy w pięciu przypadkach (przypadki 10, 12, 27, 30 i 31; Figura 1, Online Resource 1: Tabela S2).
Jak dla rearanżacji klasy C, nie znaleźliśmy żadnej osobliwości punktów przerwania połączenia, które mogłyby wyjaśnić, czy ich stabilizacja przez wychwytywanie telomerów części chromosomalnej przeciwnej do usuniętej jest spowodowana innym mechanizmem w porównaniu z przypadkami, w których wychwytywanie telomerów jest zależne od innego chromosomu. Analiza ta mogła być jednak przeprowadzona tylko w dwóch przypadkach. Stwierdzenie, że w 4 z 5 przypadków zarówno delecja, jak i duplikacja były pochodzenia ojcowskiego sugeruje, że pochodzą one albo z pierwotnej delecji, albo z pęknięcia chromosomu dicentrycznego.
Złożone niezrównoważone translokacje i inwersje (klasy B i D)
Istnieje ogólna zgoda, że te rearanżacje wynikają z pośredniego dicentrycznego, po jego asymetrycznym pęknięciu prowadzącym do inv-dup del i po prostu usuniętego chromosomu (Ryc. 1B.III). Nabycie stabilizuj±cej sekwencji telomerowej może nast±pić na wiele sposobów: poprzez telomerazowe dodanie de novo sekwencji TTAGGGG, wychwyt telomerów z dystalnej czę¶ci innego chromosomu (Yu i Graf 2010) lub z przeciwległej czę¶ci tego samego chromosomu (Buysse i wsp. 2009; Fan i Siu i wsp. 2001), a nawet utworzenie chromosomu obr±czkowego (Rossi i wsp. 2008). Dwa przypadki translokacji inv-dup del(8p), które mogliśmy genotypować (przypadki 42 i 44) powstały, zgodnie z oczekiwaniami (Giglio i wsp. 2001), przez NAHR w mat-MI, jak wykazano przez obecność dwóch matczynych i jednego ojcowskiego allela w regionie duplikacji 8p (Zasób Online 1: Tabela S2). Ta powtarzająca się nieprawidłowa rekombinacja jest pośredniczona przez wysoce identyczne segmentalne duplikacje zlokalizowane na 8p23 w obrębie normalnego i odwróconego chromosomu 8 (Giglio i wsp. 2001). W zygocie, powstały w ten sposób dicentryczny chromosom będzie prawdopodobnie ulegał różnym uszkodzeniom w różnych komórkach, prowadząc czasami do mozaiki z linią komórek del(8p) i drugą z inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), lub w wyjątkowych przypadkach nawet trzecią z inv-dup del(8p) zakończoną dystalnym regionem innego chromosomu (Pramparo 2004). Takie mozaiki są częściej wykrywane w diagnostyce prenatalnej, podczas gdy w życiu postnatalnym pojedyncza linia komórkowa z inv-dup del(8p), translokowana lub nie, jest najczęstszym znaleziskiem przynajmniej we krwi. W naszych trzech przypadkach translokacji (przypadki 42, 43 i 44), telomery zostały przekazane przez 6q, 17p i Xq, odpowiednio, wszystkie pochodzenia matczynego i z tym samym haplotypem duplikacji matczynych chromosomów 6, 17 i X, zgodnie z oczekiwaniami dla zdarzenia stabilizacji, które miało miejsce postzygotycznie. W pozostałych trzech przypadkach (przypadki 39, 40 i 45), które, jak wszystkie rearanżacje inv-dup del nieobejmujące 8p, są nienawrotowe, translokowany inv-dup był pochodzenia ojcowskiego z identycznymi ojcowskimi allelami w regionie duplikacji, podczas gdy wychwyt telomerów był zapewniony przez chromosom pochodzący od ojca w dwóch przypadkach (przypadki 39 i 49, Online Resource 2: Figury S3, S4) i matczyny w trzecim przypadku (przypadek 45), płód, w którym translokowany chromosom t(inv-dup5p;3q) był w mozaice z linią komórkową zawierającą nietranslokowany inv-dup del(5p) (Zasób Online 2: Figura S12). Zwłaszcza, że duplikacja 5p ma różną wielkość w tych dwóch liniach komórkowych (Zasób Online 1: Tabela S1), rzeczywiście pokazując, że oryginalny dicentryczny chromosom przypuszczalnie obecny w zygocie lub w bardzo wczesnym zarodku (Fig. 1b), uległ różnym pęknięciom w różnych komórkach, poza zarodkiem na etapie cleavage.
Identyczne zduplikowane allele zostały zgłoszone bona fide we wszystkich rearanżacjach inv-dup del nieobejmujących 8p, wskazując w ten sposób na intrachromosomalne pochodzenie tych rearanżacji (Hermetz i wsp. 2014). Zgodnie z tym, te translokowane rearanżacje inv-dup wydają się być końcowym rezultatem początkowego zdarzenia mitotycznego, prawdopodobnie we wczesnym zarodku (Voet 2011), takiego jak przerwanie podwójnej nici, po którym następuje parowanie wewnątrzstrandowe w stosunkowo bliskich miejscach odwróconych sekwencji homologicznych, prowadzące do wytworzenia chromosomu dicentrycznego z interpozycyjnym regionem normalnej kopii (Hermetz i wsp. 2014; Rowe i wsp. 2009). Jak już wspomniano, wzajemny produkt del inv-dup, mianowicie usunięty chromosom, może zostać naprawiony i ustabilizowany przez przechwycenie dystalnej części niehomologicznego chromosomu lub przeciwnego ramienia tego samego chromosomu, co skutkuje prostą niezrównoważoną translokacją lub inwersją, odpowiednio, jak proponujemy dla niektórych rearanżacji wymienionych w klasach A i C (Figura 1b. 1b).
Junction breakpoint
Sekwencjonowanie junction breakpoint translocation można było wykonać w 26 przypadkach (Online Resource 1: Tabela S1, Online Resource 2: Figura S1), chociaż w 4 przypadkach złożoność kryptyczna (przypadki 4, 10, 28 i 51) utrudniała dokładne sekwencjonowanie. Cechy alternatywnego niehomologicznego łączenia końców (alt-NHEJ) lub replikacji indukowanej mikrohomologią (MMBIR), takie jak mikrohomologie i szablonowane lub nie szablonowane małe insercje, wykryto w 16 przypadkach (przypadki 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 i 52) (Zasób internetowy 2: Figura S1). Co ciekawe, mimo że w przypadkach 18 i 40 rearanżacja zachodziła w obrębie sekwencji Alu, obecność odpowiednio 5 bp krótkiej insercji szablonowej i 4 bp mikrohomologii świadczyła o tym, że rearanżacja nie dokonała się w mechanizmie pośredniczonym przez NAHR, ale raczej alt-NHEJ lub MMBIR. Kanoniczna NHEJ (c-NHEJ, blunt ends junctions) wystąpiła w czterech przypadkach (przypadki 26, 29, 31 i 43). W przypadkach 2 i 38, punkty przełomowe znajdowały się na krawędzi homologicznych retrotranspozonów (Zasób Online 2: Rysunek S13). To odkrycie sugeruje, że w mniejszości przypadków mechanizmy naprawcze, takie jak wychwytywanie telomerów, są ułatwione przez te sekwencje. Chociaż Robberecht i wsp. stwierdzili, że większość ich niezrównoważonych translokacji de novo była pośredniczona przez NAHR między LINEs, HERVs lub duplikacjami segmentalnymi (Robberecht i wsp. 2013), możemy wykluczyć zdarzenie NAHR przynajmniej w przypadku 2, gdzie obecność dwóch zduplikowanych haplotypów matczynych, z których jeden uległ translokacji do chromosomu biorcy, wyraźnie wskazuje na niedysjunkcję mat-MI (Fig. 1, Online Resource 1: Table S2), uniemożliwiając tym samym przypisanie translokacji zdarzeniu mejotycznemu. Rzeczywiście, wykazano, że zdarzenia retrotranspozycji mediowane przez LINE-1 występują w komórkach somatycznych wczesnego ludzkiego zarodka, w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych, a przynajmniej u myszy głównie w embriogenezie (dla przeglądu Kazazian i Moran 2017), wspierając, że w naszych przypadkach tworzenie translokacji było również zdarzeniem postzygotycznym.
Połączone, cechy te wskazują, że mechanizmy oparte na naprawie (c-NHEJ i alt-NHEJ) oraz replikacyjne mechanizmy naprawcze (MMBIR) są odpowiedzialne za połączenie chromosomu dawcy z chromosomem biorcy, lub przeciwległym fragmentem tego samego chromosomu (Ryc. 1).
Zależność genotyp-fenotyp
Ale chociaż korelacje genotyp-fenotyp w dużych niezrównoważonych rearanżacjach, takich jak te zgłaszane w naszym badaniu, są ogólnie dość zgrubne, dane, które zgłaszamy, dodają pewne dalsze szczegóły również w tym kontekście.
Silne dowody na to, że niektóre niezrównoważone translokacje pochodzą z zygoty z supernumerarnym chromosomem, który ulega zdarzeniu chromotrypowemu, sugerują, że region duplikacji, chociaż pozornie składa się tylko z dystalnego regionu chromosomu chromotrypowego, może zawierać fragmenty z innych porcji, jak to jest w przypadku naszego przypadku 6 i jak wykazano przez Weckselblatt i wsp. (2015). W tych przypadkach, jeśli rozmiar rozbitych fragmentów jest mniejszy niż wykrywalny przez array CGH, istnieje ryzyko przypisania nieprawidłowego fenotypu tylko genom, które wydają się zduplikowane lub usunięte, podczas gdy dalsza zachorowalność może być spowodowana nieprawidłową ekspresją genów generowaną przez zaburzenie TAD (Fukami i wsp. 2017).
Co więcej, w niezrównoważonych translokacjach pochodzących z ratowania częściowej trisomii, jeśli chromotrypsja wystąpiłaby na supernumerarnym chromosomie pochodzenia ojcowskiego, następująca matczyna hetero/izodisomia dla pozostałych dwóch chromosomów może generować dalszą patogenność (Niida i in. 2018) albo poprzez redukcję do stanu homozygotycznego chorobotwórczych wariantów obecnych u matki w stanie heterozygotycznym, albo ze względu na obecność genów imprinted, które ulegają ekspresji tylko przez allel ojcowski.
Jako ostatnie rozważanie, kuszące jest spekulowanie, że wybór, który telomer jest przechwytywany do stabilizacji uszkodzonego chromosomu, może nie być przypadkowy, ale pod wpływem deregulacji pierwotnych TADs (Topologically Associated Domains), tworząc z kolei korzystne podłoże dla specyficznych kontaktów międzychromosomalnych i przestrzennej trójwymiarowej kompartmentalizacji chromatyny (Dekker i Mirny i wsp. 2016).