Abstract

Melioidoza i nosacizna są wywoływane przez blisko spokrewnione gatunki Burkholderia pseudomallei i Burkholderia mallei, odpowiednio. Podczas gdy melioidoza jest istotną przyczyną zachorowalności w południowo-wschodniej Azji, nosacizna jest niezwykle rzadka. Skuteczność ciprofloksacyny i doksycykliny była oceniana przeciwko szczepowi B. pseudomallei i szczepowi B. mallei, które były wrażliwe na oba środki przeciwdrobnoustrojowe in vitro. Myszy rasy Porton outbred i chomiki syryjskie otrzymywały 40 mg/kg mc. doksycykliny lub cyprofloksacyny dwa razy dziennie we wstrzyknięciu dożylnym według jednego z trzech schematów: dawkowanie rozpoczynające się 48 h przed zakażeniem i kontynuowane przez 5 dni po zakażeniu; 5-dniowa terapia rozpoczynająca się natychmiast po zakażeniu; 5-dniowa terapia rozpoczynająca się 24 h po zakażeniu. Myszy były prowokowane ip przez B. pseudomallei 4845, a chomiki ip przez B. mallei 23344. Skuteczność przeciwbakteryjną określano na podstawie przesunięcia mediany dawki śmiertelnej (MLD). Zarówno profilaktyka z zastosowaniem cyprofloksacyny, jak i natychmiastowa terapia podniosły MLD B. pseudomallei do 4 × 106 jtk z 19 jtk u zwierząt nieleczonych, ale terapeutyczna cyprofloksacyna podniosła MLD tylko do 180 jtk. Wyniki dla doksycykliny były podobne. Profilaktyka z zastosowaniem cyprofloksacyny podniosła MLD B. mallei 23344 do 4,6 × 105 jtk w porównaniu z 4 jtk w grupie kontrolnej nieleczonej. Natychmiastowa terapia podniosła MLD do 7,0 × 104 cfu, a leczenie podniosło MLD do 1,6 × 103 cfu. Wszystkie schematy podawania doksycykliny chroniły chomiki przed zakażeniem do 2 × 107 cfu. Pomimo zastosowania wrażliwego szczepu B. pseudomallei, żaden z leków przeciwdrobnoustrojowych nie był skuteczny przy stosowaniu terapeutycznym. Podanie obu leków w odpowiednim czasie było jednak skuteczne w zapobieganiu objawowej infekcji. Doksycyklina była lepszym z dwóch środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko eksperymentalnej nosaciznie, chociaż u leczonych zwierząt wystąpił nawrót choroby około 4-5 tygodni po zakażeniu.

Wprowadzenie

Melioidoza i nosacizna są wywoływane przez blisko spokrewnione gatunki Burkholderia pseudomallei i Burkholderia mallei. Podczas gdy melioidoza jest ważną przyczyną śmiertelności i zachorowalności w południowo-wschodniej Azji, północnej Australii i na subkontynencie indyjskim, nosacizna jest niezwykle rzadka i generalnie ogranicza się do choroby koni w niektórych częściach Bliskiego Wschodu, Azji i Ameryki Południowej.1,2

W konsekwencji, wrażliwość B. pseudomallei na środki przeciwdrobnoustrojowe została dokładnie zbadana3-5, a terapia przeciwdrobnoustrojowa melioidozy jest dobrze ugruntowana.5,6 Stosowanie fluorochinolonów w leczeniu melioidozy było generalnie wykluczone ze względu na wysokie MIC in vitro dla niektórych szczepów B. pseudomallei, które przekraczają poziomy osiągane w surowicy.4,5 Ciprofloksacyna, sama lub w połączeniu, była stosowana w leczeniu melioidozy pomimo tego przeciwwskazania7,8 na podstawie tego, że ciprofloksacyna może przenikać do komórek fagocytujących, w których przebywa B. pseudomallei, aby osiągnąć stężenie 4-12 razy większe niż stężenie zewnątrzkomórkowe.9,10 Tak więc, przy stężeniu w surowicy 2-3 mg/l, które można osiągnąć przy standardowym dawkowaniu doustnym, teoretycznie powinno się osiągnąć stężenie wewnątrzkomórkowe do 20 mg/l.11 Ponadto, stężenie w surowicy 9 mg/l można osiągnąć przez wlew dożylny, chociaż przez krótki okres czasu.11 Po drugie, być może fluorochinolony mogą być użyteczne w terapii natychmiastowej lub jako profilaktyka u osób, o których wiadomo, że były narażone lub są narażone na wysokie ryzyko narażenia na melioidozę, zwłaszcza że nie ma obecnie środków immunoprofilaktyki.

Skromne występowanie nosacizny w drugiej połowie tego wieku oznacza, że wiedza na temat wrażliwości B. mallei na środki przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie na nowoczesne środki przeciwdrobnoustrojowe, jest skąpa, a nieliczne odniesienia w najnowszej literaturze mikrobiologicznej pochodzą głównie ze źródeł rosyjskich.12-18 Podobnie, skuteczność in vivo nowoczesnych środków przeciwdrobnoustrojowych nie jest dobrze poznana. Ostatnie badania sugerują, że wrażliwość B. mallei na ciprofloksacynę jest podobna do wrażliwości B. pseudomallei in vitro.19 Ponadto B. pseudomallei i B. mallei są bardzo podobne pod względem antygenowości, biochemii i, co bardzo prawdopodobne, patogenności, szczególnie w odniesieniu do przeżywalności wewnątrzkomórkowej.20 Argumenty przemawiające za stosowaniem ciprofloksacyny w przypadku melioidozy miałyby zatem zastosowanie w przypadku nosacizny, ale jednocześnie należy wziąć pod uwagę jej słabe wyniki w badaniach klinicznych.

Doksycyklina jest stosowana samodzielnie w leczeniu zlokalizowanej melioidozy, a w połączeniu z innymi lekami przeciwdrobnoustrojowymi5 w przypadku choroby ogólnoustrojowej, dlatego może mieć pewną przydatność jako profilaktyczne lub doraźne leczenie melioidozy. Ponadto, podobnie jak cyprofloksacyna, może przenikać wewnątrzkomórkowo i jest skuteczna wobec wielu różnych patogenów wewnątrzkomórkowych.21 We wcześniejszych doświadczeniach doksycyklina wykazywała dobrą aktywność in vitro wobec B. mallei.19

Skuteczność profilaktyki i natychmiastowej terapii cyprofloksacyną i doksycykliną była mierzona przeciwko doświadczalnej melioidozie w modelu mysim i doświadczalnej nosaciznie w modelu chomiczym.

Materiały i metody

Szczepy testowe, przechowywanie i hodowla

Oba organizmy są sklasyfikowane przez Komitet Doradczy ds. Niebezpiecznych Patogenów (ACDP) jako patogeny kategorii 3, dlatego wszystkie procedury bakteriologiczne przeprowadzono w szafach bezpieczeństwa klasy 3 zgodnych z BS5726.

B. pseudomallei NCTC 4845 i B. mallei ATCC 23344 były używane jako szczepy prowokujące odpowiednio dla melioidozy i nosacizny. Oba gatunki przechowywano w temperaturze -80°C w systemie przechowywania perełek „Protect” (TSC Ltd, Heywood, Lancashire, UK) do czasu, gdy będą potrzebne. Hodowle zakaźne i liczenia wyhodowano na agarze odżywczym lub bulionie odżywczym, a badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe in vitro przeprowadzono przy użyciu bulionu Mueller-Hinton.

Przygotowanie środków przeciwdrobnoustrojowych

Do doświadczeń in vitro proszki doksycykliny (Sigma, Poole, Wielka Brytania) i cyprofloksacyny (Bayer, Newbury, Wielka Brytania) rozpuszczono w wodzie dejonizowanej, uzyskując roztwory podstawowe o stężeniu 10 mg/L. Roztwory do podawania przygotowywano codziennie na świeżo, rozpuszczając proszek doksycykliny w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, a tabletki Ciproxin (Bayer) w wodzie dejonizowanej, a następnie sterylizując roztwory przez filtr.

Testowanie wrażliwości przeciwdrobnoustrojowej in vitro

Bakterie odzyskiwano umieszczając pięć do sześciu kulek „Protect” w bulionie Mueller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, UK) i inkubując hodowle statycznie w temperaturze 37°C przez 24 godziny dla B. pseudomallei i 48 godzin dla B. mallei. Zastosowano metodę rozcieńczania na płytkach mikromiareczkowych zgodnie z wytycznymi NCCLS.22 Krótko mówiąc, 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe zawierające każdy środek przeciwdrobnoustrojowy w rozcieńczeniu od 0,063 mg/L do 64 mg/L przygotowano wcześniej i przechowywano w temperaturze -20°C. Inokulum około 5 × 105 cfu/mL (określone przy użyciu standardu McFarlanda 5) w 100 μL zostało wykonane z całonocnej lub 48-godzinnej hodowli w bulionie Mueller-Hinton i dodane do wszystkich studzienek. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 18-20 h. Ze względu na powolny wzrost B. mallei konieczne było inkubowanie płytek przez 36 h przed odczytaniem MIC.

Escherichia coli ATCC 25922 i Staphylococcus aureus ATCC 29213 (NCIMB, Aberdeen, UK) wykorzystano jako standardy kontroli jakości.

Modele zwierzęce

Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z ustawą o procedurach naukowych (zwierzęta) z 1986 r. i kodeksami postępowania w zakresie trzymania i opieki nad zwierzętami wykorzystywanymi w procedurach naukowych z 1989 r..

Kobiety myszy Porton outbred (wyhodowane we własnym zakresie) i chomiki syryjskie szczep Lakeview (Charles River, Margate, UK) wykorzystano odpowiednio do doświadczalnej melioidozy i nosacizny. Myszy trzymano w klatkach po pięć zwierząt, a chomiki w parach w izolatorze o sztywnych ścianach, zgodnym z normą BS5726. Poddawano je cyklowi oświetlenia 12 h i ciemności 12 h oraz miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. Zarówno myszy jak i chomiki otrzymywały komercyjną dietę dla gryzoni, chomiki dodatkowo otrzymywały suplementy z nasion słonecznika raz w tygodniu.

W poprzednich badaniach, rękawice z kauczuku nitrylowego noszone wraz z pół-kombinezonem zapewniły odpowiednią ochronę przed przypadkowymi ukąszeniami myszy podczas hodowli i procedur. Chociaż szczep Lakeview chomika syryjskiego jest odnotowywany ze względu na jego potulność, przemysłowe rękawice kevlarowe odporne na przebicie były noszone na rękawice z gumy nitrylowej jako środek ostrożności podczas obchodzenia się z zakażonymi chomikami.

Podawanie środków przeciwdrobnoustrojowych

Oba środki przeciwdrobnoustrojowe stosowano w dawce 40 mg/kg masy ciała, podawanej dwa razy dziennie w odstępach 12 h przez wstrzyknięcie sc w 0,1 mL u myszy i w 0.2 mL u chomików zgodnie z jednym z trzech schematów: schemat profilaktyczny, w którym środki przeciwdrobnoustrojowe rozpoczęto 48 h przed wyzwaniem i kontynuowano przez 5 dni po wyzwaniu; terapia natychmiastowa lub supresyjna ze środkami przeciwdrobnoustrojowymi podawanymi natychmiast po wyzwaniu i kontynuowanymi przez 5 dni; oraz schemat terapeutyczny składający się z 5-dniowego kursu środków przeciwdrobnoustrojowych rozpoczynającego się 24 h po wyzwaniu.

Dwóm kolejnym grupom myszy zakażonych B. pseudomallei podawano schemat profilaktyczny zgodny z opisem, z tym że antybiotyki kontynuowano przez 10 dni po zakażeniu.

Zakażenie zwierząt i ocena zjadliwości

Zjadliwość każdego patogenu określono poprzez pomiar mediany dawki śmiertelnej (MLD), zdefiniowanej jako dawka wymagana do zabicia 50% małej populacji zwierząt (25-30), obliczonej zgodnie z metodą Reeda & Muencha.23 Skuteczność przeciwdrobnoustrojowa była mierzona przez porównanie MLD leczonych zwierząt z MLD w nieleczonych kontrolach.

Kultury prowokacyjne B. pseudomallei i B. mallei przygotowano przez odzyskanie odpowiednich kulek „Protect” do bulionu odżywczego i inkubację odpowiednio przez 24 h i 48 h.

Myszy, w grupach po pięć, zakażono 0,1 mL seryjnych rozcieńczeń zawiesiny B. pseudomallei przez wstrzyknięcie ip i obserwowano przez 35 dni po zakażeniu. Chomiki, w grupach po cztery sztuki, zostały zakażone 0,2 mL seryjnych rozcieńczeń zawiesiny B. mallei drogą ip i były obserwowane przez 23 dni po zakażeniu. Osiem chomików, u których zastosowano natychmiastowe leczenie doksycykliną i osiem chomików, u których zastosowano 24-godzinny schemat leczenia doksycykliną, pozostawiono do dalszych badań przez 5 tygodni po zakażeniu. W obu modelach zwierzęcych, grupy profilaktyczne zostały zakażone w przybliżeniu w połowie drogi między dawkami środków przeciwdrobnoustrojowych.

Po scharakteryzowaniu oznak i objawów każdej z infekcji, zaobserwowano humanitarne punkty końcowe, jeśli tylko było to możliwe. Autopsje przeprowadzano w izolatce. Organy dzielono na części i rozmazano na agarze odżywczym, który inkubowano przez 24 h lub 48 h w temperaturze 37°C, odpowiednio dla B. pseudomallei i B. mallei. Identyfikację kolonii rosnących na płytkach potwierdzano za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

PCR

Pojedyncze kolonie pobierano do 200 μL dejonizowanej wody i gotowano przez 5 min. DNA amplifikowano przy użyciu starterów oligonukleotydowych komplementarnych do genów kodujących 16S rRNA B. pseudomallei i B. mallei. Amplifikację PCR przeprowadzano przez dodanie 18 μL następującej mieszaniny: 1 × bufor PCR (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Niemcy); 0.2 mM mieszaniny nukleotydów PCR (Boehringer-Mannheim), 180 ng starterów oligonukleotydowych 3′ i 5′, 5% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO) i 0,5 U polimerazy Taq (Boehringer-Mannheim) do 2 μL zawiesiny kolonii. Amplifikację przeprowadzono w termocyklerze Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Cetus, Warrington, UK) w następujących warunkach: 30 cykli 95°C przez 30 s, 50°C przez 1 min i 72°C przez 1 min, po czym następował 10-minutowy czas przedłużenia w temperaturze 72°C. Produkty PCR analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym, a pasmo produktu wizualizowano za pomocą barwienia bromkiem etydyny na 2% żelu TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA).

Wyniki

Wrażliwość in vitro

Obaj B. pseudomallei 4845 i B. mallei 23344 były wrażliwe lub umiarkowanie wrażliwe na ciprofloksacynę i doksycyklinę in vitro, przy czym B. pseudomallei był hamowany przez 2.0 mg/L ciprofloksacyny i 1,0 mg/L doksycykliny, a B. mallei hamowany przez 1,0 mg/L ciprofloksacyny i 0,25 mg/L doksycykliny.

Wrażliwość in vivo B. pseudomallei

Myszy kontrolnej podawano dootrzewnowo serię rozcieńczeń log w zakresie od 0,3 cfu do 2,9 × 103 cfu B. pseudomallei, co powodowało rozsiane i szybko śmiertelne zakażenie. Zwierzęta zaczęły chorować w ciągu 24-48 h po zakażeniu, na co wskazywały niespecyficzne objawy, takie jak piloerekcja, przy czym zwierzęta, którym podano wyższe stężenia B. pseudomallei, padały w ciągu 96 h po zakażeniu. Autopsja ujawniła bardzo niewiele zmian, chociaż bakterie mogły być izolowane z wątroby, śledziony, płuc i krwi. U zwierząt, które uległy później, stwierdzono wyraźną splenomegalię oraz, sporadycznie, hepatomegalię. Liczne małe ropnie rozwinęły się w śledzionie i trzustce, rzadziej w wątrobie. MLD spadła do 111 jtk w ciągu 7 dni od zakażenia, a następnie zmniejszała się w ciągu 3 tygodni do ostatecznej wartości MLD wynoszącej 20 jtk (ryc. 1 i 2). Autopsja zwierząt, które przeżyły nie wykazała żadnych poważnych zmian, a narządy były wolne od B. pseudomallei.

Leczone myszy zostały zakażone serią rozcieńczeń log w zakresie od 180 cfu do 1,8 × 107 cfu B. pseudomallei. Stwierdzono niewielką różnicę między skutecznością obu środków przeciwdrobnoustrojowych. Profilaktyczne lub natychmiastowe zastosowanie któregokolwiek ze środków chroniło przed bakteriami 1 × 107 cfu, podczas gdy środek przeciwdrobnoustrojowy był podawany. U kilku zwierząt wystąpił nawrót choroby w ciągu 5 tygodni, najbardziej dramatyczny w grupie stosującej profilaktycznie doksycyklinę, między 11 a 21 dniem po zakażeniu. Pod koniec doświadczenia MLD były jednak znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej, wahając się między 1,4 × 106 cfu a 4,6 × 106 cfu (ryc. 1 i 2). Autopsja zwierząt, które przeżyły, ujawniła splenomegalię u mniejszości zwierząt, chociaż nie w stopniu obserwowanym u zwierząt kontrolnych, a w niektórych przypadkach obecne były ropnie. B. pseudomallei można było wyizolować z narządów niektórych zwierząt, w tym tych bez widocznych zmian brutto.

Terapeutyczne zastosowanie któregokolwiek ze środków przeciwdrobnoustrojowych opóźniło przebieg zakażenia, ale w ciągu 5 tygodni zapewniło minimalną ochronę z końcową MLD dla ciprofloksacyny wynoszącą 180 cfu i dla doksycykliny 640 cfu (ryc. 1 i 2).

Wrażliwość in vivo B. mallei

Hamery zakażono dootrzewnowo serią rozcieńczeń log w zakresie od 0,3 cfu do 2,9 × 107 cfu B. mallei. Infekcja przebiegała bardzo szybko i charakteryzowała się charakterystycznymi objawami. W ciągu 24-48 godzin zwierzęta stawały się przytłumione i mniej aktywne. Początkowym objawem choroby było pojawienie się wodnistej wydzieliny z oczu, która stała się ropna. Późniejsze objawy obejmowały obrzęk kończyn i wyczuwalne palpacyjnie trzeszczenie opłucnej. Wszystkie przypadki śmiertelne/ludzkie punkty końcowe wystąpiły w ciągu 7 dni po zakażeniu (rysunek 3). Autopsja ujawniła niewiele zmian, przy czym dominującą cechą była splenomegalia, sporadycznie z ropniami występującymi zarówno w śledzionie, jak i trzustce.

Profilaktyczne leczenie ciprofloksacyną i natychmiastowe leczenie ciprofloksacyną chroniło zwierzęta przed zakażeniem do 2,9 × 107 jtk przez 18 dni, po czym następował nagły nawrót, w wyniku którego MLD spadało odpowiednio do 4,6 × 105 jtk i 7 × 104 jtk pod koniec doświadczenia (rysunek 3). Autopsja zwierząt, które poniosły śmierć, ujawniła powiększoną śledzionę zawierającą jeden lub dwa duże ropnie. Autopsja zwierząt, które przeżyły, ujawniła na ogół powiększenie śledziony z okazjonalnym ropniem, z którego można było wyizolować B. mallei.

Po rozpoczęciu leczenia ciprofloksacyną, u ośmiu zwierząt, którym stawiano najwyższe wymagania, wystąpiły objawy choroby. Stan dwóch zwierząt pogorszył się pomimo leczenia, stan trzech zwierząt pozostał stabilny bez dalszego pogarszania się, ale bez wyraźnej poprawy, a stan trzech zwierząt poprawił się. Z wyjątkiem dwóch wczesnych przypadków, zwierzęta przetrwały zakażenie do 2,9 × 107 cfu przez 11 dni. Nawroty wystąpiły między 11 a 18 dniem początkowo u tych zwierząt, u których wystąpiła choroba objawowa. Nawroty w grupach o niższym poziomie zakażenia występowały od 18 dnia do końca doświadczenia, a końcowa MLD w 23 dniu po zakażeniu wynosiła 1,6 × 103 cfu (rysunek 3). Wyniki autopsji zwierząt, które poniosły śmierć i które przeżyły, były identyczne jak w przypadku innych schematów.

Wszystkie schematy doksycykliny chroniły chomiki przed wyzwaniem do 2,9 × 107 cfu bez nawrotów obserwowanych podczas 23-dniowego okresu doświadczalnego, w tym poprawy u ośmiu objawowych chomików w grupie terapeutycznej. Autopsja zwierząt, które przeżyły, ujawniła splenomegalię u niektórych zwierząt, chociaż nie stwierdzono obecności B. mallei.

Nawrót choroby wystąpił jednak u zwierząt, które zostały zatrzymane, przy czym choroba pojawiła się ponownie u czterech z ośmiu chomików, którym podano natychmiastową terapię i u jednego ze zwierząt otrzymujących schemat terapeutyczny 28-31 dni po zakażeniu. Autopsja ujawniła liczne ropnie w śledzionie, wątrobie i trzustce, z których wyizolowano B. mallei.

Dyskusja

Obaj B. pseudomallei i B. mallei podane dootrzewnowo wywołały szybko inwazyjną i śmiertelną infekcję w odpowiednich modelach zwierzęcych odtwarzających piorunującą infekcję ogólnoustrojową podobną do tej występującej w ludzkiej melioidozie i nosaciznie. Jednakże, melioidoza i nosacizna mają inne postacie kliniczne, w tym przewlekłą infekcję ropną lub spokojną infekcję, która może trwać kilka lat zanim stanie się symptomatyczna.2,24,25 Opisane tutaj modele zwierzęce mogą być manipulowane w celu odtworzenia przewlekłych infekcji. W doświadczalnej melioidozie, przewlekłe zakażenie ropne u myszy może wystąpić u niektórych zwierząt po podskórnym prowokowaniu lub przez zastosowanie różnych szczepów myszy, takich jak C57B6 inbred lub Swiss-Webster outbred (dane niepublikowane). Zakażenie B. mallei u myszy Balb/C, C57B6 i Swiss-Webster outbred prowadzi do przewlekłej, nieśmiertelnej choroby i przewlekłej, śmiertelnej choroby z wysoką MLD u myszy Porton outbred (dane niepublikowane). W tych doświadczeniach interesujący był model ostry, prawdopodobnie reprezentujący „gorszy przypadek” zakażenia, który w przypadku zapobiegania przez ciprofloksacynę lub doksycyklinę może również zahamować rozwój choroby przewlekłej. Ponadto, wiele przypadków melioidozy występuje jako ostra choroba, chociaż może być niejasne, czy zakażenie jest niedawne, czy stanowi ostry „kryzys” u pacjentów, którzy mogli być nosicielami subklinicznych zakażeń przez długi okres czasu.

Interesującą cechą choroby w modelach zwierzęcych było zaangażowanie trzustki jako miejsca ropni, szczególnie zauważalne w modelu chomika. Zarówno w przypadku B. pseudomallei, jak i B. cepacia odnotowano wiązanie z insuliną26 , co może wskazywać na zdolność do wiązania się z receptorami insuliny, co tłumaczyłoby zajęcie trzustki. Ponadto cukrzyca jest częstym czynnikiem predysponującym do wystąpienia choroby u ludzi, chociaż w niektórych przypadkach przewlekłej choroby nie jest jasne, czy B. pseudomallei powoduje cukrzycę, czy też cukrzyca jest przyczyną objawów choroby. Choroba trzustki w melioidozie u ludzi jest jednak rzadka5 , a jej znaczenie w nosaciznie nie jest znane.

Donoszono, że cyprofloksacyna i doksycyklina są gorsze od innych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych pojedynczo lub w połączeniu, w leczeniu melioidozy u ludzi i wiążą się z wysokim wskaźnikiem nawrotów.7,8 Wyniki kliniczne odzwierciedlały wyniki obserwowane w grupach terapeutycznych w tych badaniach, nawet gdy szczep doświadczalny był wrażliwy lub umiarkowanie wrażliwy na każdy środek przeciwdrobnoustrojowy, a poziomy surowicy i tkanek środka przeciwdrobnoustrojowego przekraczały MIC in vitro. MIC cyprofloksacyny przeciwko B. pseudomallei 4845 był typowy dla 50% szczepów B. pseudomallei badanych w szerszym badaniu przeprowadzonym w naszym laboratorium19, ale niski w porównaniu z innymi badaniami.3,4 MIC doksycykliny był najwyższy zmierzony dla wszystkich szczepów B. pseudomallei badanych w laboratorium19, ale ponownie niski w porównaniu z innymi badaniami.5 Profilaktyczne i natychmiastowe poekspozycyjne stosowanie ciprofloksacyny lub doksycykliny zapewniało dobrą ochronę, chociaż możliwość profilaktyki lub natychmiastowej terapii w przypadkach klinicznych byłaby ograniczona do sytuacji takich jak wypadki w laboratoriach lub natychmiastowa terapia zapobiegawcza po urazie w obszarach endemicznych. Eksperymenty wykazały, że „okno możliwości”, tj. czas pomiędzy ekspozycją na patogen a skutecznym zapobieganiem infekcji za pomocą środków przeciwdrobnoustrojowych był krótszy niż 24 godziny po zakażeniu.

Niektóre nawroty wystąpiły w grupach stosujących profilaktykę i terapię natychmiastową, co można przypisać wielu czynnikom; przede wszystkim, że czas trwania podawania środków przeciwdrobnoustrojowych był krótki, chociaż klinicznie schemat byłby przedłużony, gdyby stosowano profilaktykę. Istotna jest również farmakokinetyka porównawcza każdego środka przeciwdrobnoustrojowego w stosunku do MIC in vitro oraz zdolność bakterii do przebywania w uprzywilejowanych miejscach wewnątrzkomórkowych, które mogą być niedostępne dla środków przeciwdrobnoustrojowych.

Przedłużenie podawania doksycykliny do 10 dni po wyzwaniu zapobiegło nawrotom (przypadki śmiertelne nadal występowały w okresie podawania), ale przedłużenie podawania cyprofloksacyny zwiększyło liczbę nawrotów. Farmakokinetyka doksycykliny była lepsza w odniesieniu do eradykacji B. pseudomallei w porównaniu z cyprofloksacyną. Doksycyklina osiągała szczytowe stężenie w surowicy 3,7 mg/l, a stężenie w surowicy przekraczało MIC przez 24 h po podaniu. Szczytowe stężenie w śledzionie wynosiło 4,1 mg/kg, przy czym stężenie przekraczało 1 mg/kg przez 9 h. Szczytowe stężenie cyprofloksacyny w surowicy wynosiło 2,9 mg/l, przy czym MIC było przekroczone tylko przez 1 h po podaniu, a szczytowe stężenie w śledzionie wynosiło 10,3 mg/kg i utrzymywało się powyżej 2 mg/kg przez 3 h (dane niepublikowane). Pomimo korzystnej farmakokinetyki, B. pseudomallei był odzyskiwany od zwierząt, które przeżyły ze wszystkich grup, w tym od tych, którym podawano środki przeciwdrobnoustrojowe przez 10 dni. Na podstawie tych doświadczeń trudno jest przewidzieć potencjał nawrotu choroby, jaki stwarzają te bakterie, które przeżyły.

Podobieństwa w farmakokinetyce dwóch środków przeciwdrobnoustrojowych u chomików odpowiadały za różnice w skuteczności doksycykliny i cyprofloksacyny wobec B. mallei. Zastosowany szczep był wrażliwy na oba środki przeciwdrobnoustrojowe, MIC dla cyprofloksacyny było typowe dla 50% badanych szczepów, chociaż MIC dla doksycykliny było jednym z najniższych. Szczytowe stężenia cyprofloksacyny w surowicy chomika wynosiły 2,3 mg/l, przy czym MIC był przekroczony tylko przez 1 h. Stężenia w śledzionie osiągały maksymalnie 20 mg/kg i pozostawały większe niż 1 mg/kg przez co najmniej 12 h. Stężenia doksycykliny w surowicy osiągały 2,6 mg/l i pozostawały powyżej 0,25 mg/l przez co najmniej 12 h. Stężenia w śledzionie osiągały 8,7 mg/kg i pozostawały powyżej 0,25 mg/kg przez co najmniej 12 h (dane niepublikowane). Ponieważ nosacizna jest tak rzadką chorobą, mechanizmy patogenetyczne i czynniki wirulencji B. mallei nie zostały poddane takim samym badaniom, jak w przypadku B. pseudomallei. Jednak podobieństwa między tymi dwoma organizmami mogą dotyczyć penetracji wewnątrzkomórkowej i przeżycia, co może być przyczyną nawrotów choroby. Biorąc pod uwagę te podobieństwa, doświadczenie kliniczne w leczeniu melioidozy służy jako ostrzeżenie dla potencjalnych schematów przeciwdrobnoustrojowych przeciwko nosaciznie, w szczególności, że pomimo korzystnej farmakokinetyki i pozornej podatności, nawracające zakażenie może nadal występować.

W tych doświadczeniach, oba środki przeciwdrobnoustrojowe wykazały pewną użyteczność w profilaktyce melioidozy, ale nie nadawały się do użytku terapeutycznego, odzwierciedlając wyniki kliniczne. Potencjalnie doksycyklina mogłaby być stosowana w zapobieganiu i leczeniu nosacizny, chociaż problemy napotkane w leczeniu melioidozy mogą również dotyczyć nosacizny.

Abstrakt został po raz pierwszy odczytany na Międzynarodowym Kongresie na temat Melioidozy, który odbył się w Bangkoku, Tajlandia, 22-25 listopada 1998 r.

.