3 Inhibitory amylazy

α-Amylaza (1,4-α-d-glukan-glukanohydrolaza, EC3.2.1.1) jest endoglukanazą, która katalizuje hydrolizę endo α-(1,4) wiązań glikozydowych w skrobi i pokrewnych polisacharydach. Hydroliza skrobi jest najpierw katalizowana przez α-amylazę obecną w ludzkiej ślinie, a następnie przez amylazę trzustkową w dwunastnicy. Ludzka α-amylaza trzustkowa (HPA) jest ważnym celem farmakologicznym w leczeniu cukrzycy typu 2. Jednakże, koszt HPA jest stosunkowo wysoki dla celów badawczych. Zamiast tego, w pomiarach trawienia in vitro wykorzystuje się α-amylazę trzustki świńskiej (PPA). PPA składa się z 496 reszt aminokwasowych i wykazuje 83% identyczność z jej ludzkim odpowiednikiem HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA jest amylazą endo-typu i katalizuje hydrolizę wewnętrznych wiązań α-(1,4) glikozydowych w amylozie i amylopektynie poprzez wielokrotny atak w kierunku końca nieredukującego (Robyt & French, 1970). Produktami hydrolizy α-amylazy trzustkowej świń są głównie maltoza, maltotrioza i maltotetraoza (Yook & Robyt, 2002). PPA ma dwa izomery PPA izozym-I (PPA-I) i PPA-II, które mają taką samą masę cząsteczkową, ale różnią się nieznacznie składem aminokwasowym i punktem izoelektrycznym (Pasero i in., 1986).

Naturalnie występujące inhibitory α-amylazy obejmują inhibitory białkowe i metabolity wtórne. Te pierwsze są poza zakresem tego artykułu, ponieważ mają tendencję do denaturacji podczas obróbki termicznej lub kwaśnej (kwasowość żołądka) i tracą swoją aktywność po dotarciu do jelita cienkiego. W niniejszym artykule podsumowujemy najnowszą literaturę dotyczącą inhibitorów α-amylazy. Wymieniono również metody stosowane do pomiaru ich aktywności inhibicyjnej, ponieważ różne metody mogą skutkować różnymi wartościami IC50. W porównaniu z α-glukozydazą, mniej doniesień dotyczy α-amylazy, a większość badań dotyczy polifenoli.

Isookanina (57) (Rys. 3.8) wyizolowana z igliwia hiszpańskiego, Bidens bipinnata, wykazała umiarkowaną aktywność hamującą HPA (IC50 0.447 mg/mL lub 156 μM) mierzoną przy użyciu testu jodometrycznego (Yang et al., 2012). Należy zauważyć, że izookanina zawiera dwie jednostki katecholowe, a zatem oczekuje się, że będzie dobrym reduktorem, który może redukować jod powodując fałszywie pozytywne wyniki.

Rysunek 3.8. Struktury chemiczne inhibitorów amylazy, związków 57-59, kwasu 5-kafeoilochinowego i kwasu 4,5-dikafeoilochinowego.

Z liścia nostrzyka wodnego (Syzygium aqueum) wyizolowano mirycetynę-3-O-rahamnozyd (9) i europetynę-3-O-rahamnozyd (10) (Rys. 3.2), a aktywność hamowania α-amylazy mierzona metodą DNSA była 10-krotnie (EC50 ~ 2,0 μM) silniejsza niż akarbozy (EC50 19 μM). Tak wysoka aktywność jest dość rzadko spotykana w związkach polifenolowych i wymaga dalszych badań, szczególnie w zakresie mechanizmu inhibicji i selektywności, gdy związki te są kwestionowane w złożonej matrycy żywności. Myricetyna jest silnym zmiataczem rodników i dlatego stabilność 9 i 10 jest również niepokojąca. Autorzy donoszą, że kwercetyna miała porównywalne EC50 (17 μM) jak akarboza (19 μM). Przy użyciu testu zmętnienia, który opracowaliśmy w naszym laboratorium, nie udało nam się wykryć żadnej aktywności hamującej kwercetyny wobec α-amylazy trzustkowej przy użyciu akarbozy jako standardu odniesienia (Huang i wsp., wyniki niepublikowane). Dlatego należy sprawdzić, czy podawane EC50 jest zależne od metody, aby wykluczyć potencjalny artefakt (Manaharan i in., 2012). Cleistocalyx operculatus również należy do rodziny Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi i Lu (2012) wyizolowali i oczyścili 2′4′-dihydroksy-6′-metoksy-3′5′-dimetylochalkon (DMC) z suszonych pąków kwiatowych C. operculatus. Związek ten wykazywał niekompetycyjny mechanizm hamowania PPA (Hu i in., 2012).

Tilirozyd (58) (Rys. 3.8), wyizolowany z nasion róży stulistnej Rosa canina L., hamuje PPA z IC50 równym 280 mM, a badania kinetyczne wykazały, że jest on niekompetycyjnym inhibitorem z wartościami Ki wynoszącymi 84,2 μM, oznaczonymi ilościowo przy użyciu p-nitrofenylo-alfa-d-pentaglukozydu jako substratu. W przeciwieństwie do akarbozy, tilirozyd nie wykazuje aktywności hamującej wobec α-glukozydazy. Być może z powodu słabego działania hamującego α-amylazę w modelu zwierzęcym, aby zmniejszyć poposiłkowe stężenie glukozy w osoczu myszy, którym podawano skrobię w dawce 2 g/kg, konieczne jest zastosowanie dużej dawki tilirozydu (600 mg/kg). Tilirozyd może wykazywać działanie antyhiperglikemiczne poprzez hamowanie zarówno zależnego od sodu transportera glukozy 1, jak i pośredniczącego w wychwycie glukozy transportera 2 w enterocytach (Goto i in., 2012).

Sugeruje się, że kurkumina i jej pochodne są związkami o wielu celach, które mają bardzo szeroki zakres korzyści zdrowotnych. Jako potencjalny środek łagodzący szybkość trawienia skrobi, bisdemethoxycurcumin (59) (Rys. 3.8) z kłącza Curcuma longa wykazuje aktywność hamowania HPA i PPA z wartościami IC50 wynoszącymi około 25 μM przy użyciu testu DNSA. Badanie kinetyczne wykazało, że jest on niekonkurencyjnym inhibitorem HPA z pozornym Ki wynoszącym 3,0 μM (Ponnusamy i in., 2012).

Mono- i disubstytuowane kwasy kafeilochinowe są głównymi związkami polifenolowymi występującymi w zielonych ziarnach kawy. Ze względu na obecność trzech drugorzędowych grup hydroksylowych w pierścieniu kwasu chinowego, istnieją trzy izomery monopodstawionych kwasów kafeilochinowych i trzy kwasy chinowe dicaffeoylowe, które zostały oczyszczone z zielonych ziaren kawy. Ich aktywność inhibicyjną na PPA-I (Narita & Inouye, 2011) mierzono przy użyciu p-nitrofenylo-diglukozydu, z którego po hydrolizie powstaje p-nitrofenol i maltoza. Godne uwagi jest to, że aktywność inhibicyjna jest wysoce zależna od pozycji grup kafeylowych w kwasie monokofeilochinowym. Kwas 5-kofeilochinowy (powszechnie znany jako kwas chlorogenowy) (rys. 3.8) ma wyższą aktywność inhibicyjną z IC50 80 μM, w porównaniu z kwasem 4-kofeilochinowym (120 μM) i kwasem 3-kofeilochinowym (230 μM). Dla trzech izomerów kwasu dicaffeoylchinowego aktywność inhibicyjna jest znacznie wyższa i nie są tak wrażliwe na położenie grup estrowych, ponieważ kwasy 3,4- i 4,5-dicaffeoylchinowy (Rys. 3.8) mają takie same wartości IC50 (20 mM), a kwas 4,5-dicaffeoylchinowy ma IC50 30 μM (Narita & Inouye, 2011).