Nucleic Acid Amplification Tests & Their Performance

Konwencjonalne testy diagnostyczne, takie jak hodowla i enzymatyczna próba immunologiczna, stosowane wcześniej do wykrywania chlamydii, nie miały odpowiedniej czułości, wymagały żywych organizmów, sterylnego sprzętu, rygorystycznych warunków transportu i inwazyjnego pobierania próbek, w tym badania przez wziernik u kobiet i wymazu z cewki moczowej u mężczyzn, co wymagało przeszkolonego pracownika służby zdrowia i warunków klinicznych z salą badań. Wraz z pojawieniem się technologii testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) do badania chlamydii, mamy obecnie dostęp do bardziej czułych testów, które generalnie mogą pozwolić na użycie samodzielnie pobranych próbek z materiału pobranego dalej od pierwotnego miejsca infekcji (np. mocz w przypadku infekcji szyjki macicy), które w konsekwencji mogą zawierać mniej organizmów niż w wymazach pobranych przez lekarza. Ponadto, warunki transportu są mniej krytyczne dla wyników testu, co oznacza, że próbki te mogą być pobierane poza tradycyjną kliniką, a w niektórych przypadkach mogą być nawet przesyłane pocztą do laboratorium diagnostycznego.

Pomimo, że pojawienie się testów NAAT zrewolucjonizowało badania na obecność chlamydii, istnieje szereg czynników, które należy rozważyć przy interpretacji wyników badań lub wyborze testu do użycia. Obejmuje to zrozumienie, w jaki sposób test został pierwotnie oceniony do użycia, świadomość tego, co oznacza wynik pozytywny lub negatywny i jak bardzo jest on wiarygodny oraz docenienie tego, jak wydajność testu może się różnić w innych grupach populacyjnych.

Jak test został oceniony do użycia?

Czułość i swoistość to dwie kluczowe statystyki używane do oceny wydajności testu przesiewowego w porównaniu z metodą złotego standardu. Czułość to prawdopodobieństwo, że wynik testu diagnostycznego będzie pozytywny, biorąc pod uwagę, że prawdziwa diagnoza jest pozytywna; a swoistość to prawdopodobieństwo, że wynik testu diagnostycznego będzie negatywny, biorąc pod uwagę, że prawdziwa diagnoza jest negatywna. Najlepsze testy przesiewowe mają wysoką czułość i wysoką specyficzność. Niska czułość prowadzi do wysokiej liczby wyników fałszywie ujemnych, a niska swoistość do wysokiej liczby wyników fałszywie dodatnich. Wyrażono obawy co do wiarygodności opublikowanych danych dotyczących czułości i swoistości NAAT dla chlamydii, ponieważ nie ma obecnie złotego standardu testu. Tradycyjnie, hodowla chlamydii służyła jako złoty standard i uważa się, że ma prawie 100% swoistość; jednakże, w porównaniu z NAAT, hodowla ma znacznie niższą czułość, ponieważ wykrywa tylko żywe organizmy. W rezultacie, oszacowanie czułości i swoistości nowego testu poprzez porównanie jego wydajności z hodowlą, może skutkować tendencyjnym oszacowaniem czułości i swoistości nowego testu. W próbie zminimalizowania tej tendencyjności, podejście analizy rozbieżności zostało początkowo zaproponowane do oceny NAAT dla chlamydii poprzez wykonanie innego NAAT na próbce w celu rozstrzygnięcia „prawdziwych” wyników. Jeśli ten dodatkowy test był pozytywny, wówczas wynik pozytywny był uważany za prawdziwie pozytywny. Pojawiły się obawy, że metoda ta może prowadzić do przeszacowania czułości i swoistości; jednakże, jej stosowanie zostało zaniechane. W jej miejsce zaproponowano inne podejście do szacowania, algorytm PISA (patient-infected-status algorithm). Zaproponowano kilka wersji PISA, ale zasadniczo PISA polega na użyciu wielu testów w celu zdefiniowania „złotego standardu”, a czułość i swoistość nowego testu jest następnie porównywana z tym standardem. Wykazano jednak, że PISA może również generować tendencyjne oszacowania parametrów wydajności testu. W serii symulowanych scenariuszy przeprowadzonych przez Hadgu i współpracowników, żaden z 95% CI dla opartych na PISA szacunków czułości i chorobowości nie zawierał prawdziwych wartości. Ponadto, oszacowania czułości i swoistości oparte na PISA zmieniają się znacząco wraz ze zmianą prawdziwej chorobowości. Bardziej zaawansowane techniki modelowania statystycznego, takie jak modelowanie klasy ukrytej, zostały zaproponowane jako alternatywa dla oceny wyników testu. Podczas gdy PISA jest zatwierdzona przez US FDA do oceny testów diagnostycznych na chlamydię, zarówno PISA jak i modelowanie klasy ukrytej są obecnie wykorzystywane do oceny testów.

Jak wiarygodny jest wynik pozytywny?

Przetwarzalność NAAT, miara stopnia, w jakim wyniki testu pozostają spójne w wielokrotnych badaniach tej samej próbki w tych samych warunkach testu diagnostycznego lub przesiewowego, ma pierwszorzędne znaczenie. Testy NAAT miały w przeszłości poważne problemy z odtwarzalnością. Około dekadę temu, reakcja łańcuchowa ligazy firmy Abbott Laboratories (IL, USA) miała wiele nagłośnionych problemów, które ostatecznie doprowadziły do wycofania testu z rynku. W przeglądzie odtwarzalności chlamydia NAAT, Hadgu i wsp. stwierdzili, że w przypadku badań wykorzystujących PCR, od 37,5 do 96,7% pozytywnych wyników zostało potwierdzonych; a w przypadku amplifikacji z przemieszczeniem nici (SDA), od 79,3 do 93,7% pozytywnych wyników zostało potwierdzonych. W innym badaniu Schachter i współpracownicy oceniali odtwarzalność i stwierdzili, że 96,7% pozytywnych wyników przy użyciu PCR, 83,8% SDA i 97,7% TMA zostało potwierdzonych. Hadgu i wsp. zaobserwowali, że wiele problemów z odtwarzalnością NAAT występuje w próbkach o niskim poziomie dodatnim, w związku z czym niektórzy autorzy zalecają ponowne badanie próbek o niskim poziomie dodatnim jako sposób na zmniejszenie liczby potencjalnych wyników fałszywie dodatnich. Inni traktują te nisko dodatnie próbki jako prawdziwie dodatnie i nie uważają, że ponowne badanie jest konieczne, ponieważ twierdzą, że „niepowodzenie powtórzenia testu pozytywnego nie oznacza, że początkowy wynik testu był fałszywie dodatni”. Jednakże, biorąc pod uwagę potencjalny wpływ pozytywnego wyniku testu na obecność chlamydii na osobę oraz potencjalny wpływ, jaki pozytywna diagnoza może mieć na związek, pozytywne wyniki powinny być interpretowane z uwzględnieniem historii seksualnej danej osoby oraz obrazu klinicznego, a w przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy rozważyć ponowne badanie.

Należy również pamiętać, że przy interpretacji pozytywnego wyniku, NAAT nie wymaga obecności żywych organizmów. NAAT charakteryzują się wyższą czułością analityczną, ponieważ mogą potencjalnie wytworzyć pozytywny sygnał z zaledwie jednej kopii docelowego DNA lub RNA w reakcji. Jednakże, ten wysoki poziom czułości może stwarzać problemy, ponieważ, chociaż pozytywny wynik NAAT może odzwierciedlać kliniczne zakażenie, test może również amplifikować martwe organizmy lub być pozytywny w wyniku zanieczyszczenia powierzchni (w tym zanieczyszczenia pojemnika w przypadku próbek pobranych samodzielnie) i w związku z tym dawać diagnozę fałszywie pozytywną. W związku z tym ważne jest, aby osoba nie była poddawana ponownym badaniom zbyt szybko po leczeniu infekcji. Badania dotyczyły dynamiki usuwania DNA lub RNA chlamydii po leczeniu zakażenia chlamydią. W jednym z badań z udziałem 115 kobiet, u których zdiagnozowano chlamydię, stwierdzono, że 7 i 14 dni po leczeniu, odpowiednio 54 i 21% kobiet nadal miało wykrywalne rRNA w samodzielnie pobranych wymazach z pochwy. W innym niedawno przeprowadzonym badaniu prospektywnie obserwowano 59 leczonych zakażeń szyjki macicy i/lub odbytu u 52 kobiet i mężczyzn oraz systematycznie oceniano obecność plazmidowego DNA i rRNA chlamydii poprzez wielokrotne sekwencyjne pomiary w czasie 8 tygodni. Badanie to wykazało, że wysoki odsetek (42%) zakażeń chlamydiami dał wynik pozytywny w co najmniej jednej z próbek pobranych po 3 tygodniach, a także częste przerywane dodatnie wyniki badań chlamydii w czasie. Chociaż w żadnym z tych badań nie można wykluczyć możliwości wystąpienia nowego zakażenia, ich wyniki sugerują, że zbyt wczesne przeprowadzenie ponownych badań po zakończeniu leczenia może prowadzić do fałszywie dodatniego rozpoznania. Aktualne wytyczne CDC dotyczące leczenia chorób przenoszonych drogą płciową zalecają, aby nie wykonywać testu wyleczenia w 3-4 tygodnie po leczeniu, a obecnie zalecają, aby kobiety i mężczyźni niebędący w ciąży, u których rozpoznano chlamydię, byli poddawani ponownemu badaniu 3 miesiące po uzyskaniu dodatniego wyniku.

Jak wiarygodny jest wynik negatywny?

Fałszywo ujemne wyniki z powodu mutacji w docelowym genie komercyjnych testów to kolejna kwestia, która może wpłynąć na wydajność testu i podkreśla znaczenie ciągłego nadzoru w celu zapewnienia, że jakikolwiek spadek liczby diagnoz chlamydii nie jest spowodowany wprowadzeniem mutacji w szczepach obecnie krążących w populacji. Przykładem tego jest wariant chlamydii zidentyfikowany w Szwecji w 2006 roku, z delecją 377 par zasad w kryptycznym plazmidzie. Odkrycie to nastąpiło po nieoczekiwanym 25% spadku liczby zakażeń chlamydią pomiędzy listopadem 2005 a sierpniem 2006 w okręgu Halland, w południowo-zachodniej Szwecji. Miało to istotne konsekwencje dla diagnostyki zakażeń chlamydiami, biorąc pod uwagę, że kilka komercyjnie dostępnych testów na obecność chlamydii zostało dotkniętych tym problemem.

Czy wydajność testu zmienia się w różnych grupach populacyjnych?

Inną ważną statystyką używaną do opisania wydajności testu diagnostycznego jest pozytywna wartość predykcyjna (PPV). PPV to odsetek osób, u których wynik testu jest dodatni, a które rzeczywiście mają chorobę. Jest ona związana z częstością występowania choroby w populacji, a wraz ze wzrostem częstości występowania wzrasta PPV testu. Przy niskiej chorobowości PPV spada, a odsetek fałszywie dodatnich wyników testu wzrasta. Rysunek 2 poniżej przedstawia zależność pomiędzy PPV a chorobowością dla NAAT o czułości 90% i różnych poziomach swoistości. Warto zauważyć, że przy niskich szacunkach chorobowości następuje gwałtowny spadek PPV, co oznacza wysoki odsetek rozpoznań fałszywie dodatnich. Rycina ta pokazuje, że przy 4% chorobowości i 97% swoistości PPV wynosi około 50%, co oznacza, że połowa pozytywnych wyników testu NAAT będzie stanowić wyniki fałszywie dodatnie, natomiast przy 99,5% swoistości odsetek fałszywie dodatnich testów spada do 12%.

Fałszywo-dodatnie wyniki badań w kierunku chlamydii mają znaczące konsekwencje dla zdrowia publicznego. Po pierwsze, fałszywie dodatnie rozpoznania mogą mieć znaczną szkodę społeczną i psychologiczną dla jednostki, jak również dla jej lub jego związku, co jest czynnikiem, którego nie należy lekceważyć. Po drugie, szacunki dotyczące zachorowalności i chorobowości zostaną przeszacowane, co doprowadzi do tendencyjnego monitorowania nadzoru i wyników badań; ma to również wpływ na analizy efektywności pod względem kosztów. Wreszcie, wyniki fałszywie dodatnie będą nieuchronnie prowadzić do nadmiernego leczenia poszczególnych osób.

.