- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Principio de inmunoensayo de microlente
- 3. Estructura y funciones de un instrumento de inmunoensayo con microlentes
- 3.1. Sistema de irradiación de luz paralela
- 3.2. Sistema de imágenes de alta resolución con enfoque automático
- 3.3. Sistema automático inteligente de reconocimiento y análisis de imágenes
- 3.4. Sistema de control de temperatura
- 3.5. Placa de prueba de microlente
- 4. Aplicación del sistema de imágenes de microesferas inmunes
- 4.1. Medición de la reacción antígeno-anticuerpo
- 4.2. Medición de muestras clínicas
- 6. Conclusiones
- Conflictos de intereses
- Contribuciones de los autores
- Agradecimientos
Resumen
La detección y el análisis de la reacción antígeno-anticuerpo es una de las técnicas de detección más críticas en los campos de la medicina, la biología, la ciencia medioambiental y la seguridad alimentaria. Los métodos tradicionales y clásicos para la detección de antígenos y anticuerpos se enfrentan a muchos problemas, como la pérdida de tiempo, el alto coste y la baja precisión. Se utiliza una novedosa técnica de imagen de microesferas inmunes mediante la microlente para comprobar los cambios del índice de refracción antes y después de la reacción antígeno-anticuerpo. Puede realizar rápidamente la determinación cualitativa y cuantitativa de la reacción antígeno-anticuerpo sin ningún tipo de etiquetado, premodificación, poslavado y costosas enzimas. Aquí presentamos y discutimos su principio y ventajas, la estructura de un instrumento de inmunoensayo con microlentes y su potencial en la medición de muestras clínicas. Es prometedor su desarrollo para la aplicación al diagnóstico de enfermedades clínicas.
1. Introducción
Las técnicas comunes disponibles hoy en día para la detección de antígenos y anticuerpos incluyen el ensayo inmunoenzimático (ELISA), la resonancia de plasmón de superficie (SPR), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunocromatográfico de oro coloidal (GICT), el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA), el ensayo inmunológico de quimioluminiscencia (CLIA) y el inmunoensayo turbidimétrico mejorado por partículas (PETIA). El ELISA combina la amplificación de la reacción catalizada por la enzima y la reacción específica del antígeno y el anticuerpo con alta precisión y bajo coste, pero sus procedimientos son complicados con un estricto control de las condiciones. La SPR se desarrolló en la década de 1990 para detectar la interacción entre biomoléculas y otras moléculas, y no requiere ningún etiquetado y puede obtener el resultado rápidamente, pero su equipo es caro y necesita un gran volumen de muestra . El RIA tiene las características de alta sensibilidad, fiabilidad y baja necesidad de volumen de muestra. Se utiliza ampliamente en la detección de proteínas, enzimas y otras moléculas, pero el radionúclido es perjudicial para la salud y también altera las actividades biológicas de las muestras, lo que conduce a un error experimental. Como un nuevo tipo de técnica de inmunoensayo y uno de los métodos más comunes para la detección de antígenos y anticuerpos, la GICT es fácil, simple y rápida con bajo coste, pero su tamaño de muestra es limitado con baja sensibilidad . La CLIA, la IFA y la PETIA también se utilizan ampliamente en la detección de antígenos y anticuerpos. Sus ventajas comunes son que son muy precisos, estables, fáciles y rápidos, pero con un coste elevado y un gran volumen de muestra.
Una técnica de imagen de microlente inmune para probar el cambio de índice de refracción puede romper las limitaciones de los métodos anteriores. Es rápido, sensible y simple con la no contaminación y el bajo costo para la detección y se espera que sea ampliamente aplicado a las instituciones médicas primarias . Esta técnica consiste en la irradiación de luz paralela, la cámara de alta resolución, el software de análisis inteligente, el autoenfoque y los sistemas de control de la temperatura con una placa de prueba de muestras de microlentes de varios pocillos y puede lograr la detección de múltiples pasos del antígeno y el anticuerpo . El sistema de cámara de alta resolución puede cumplir con los requisitos de imágenes de microlente, y el uso del controlador de temperatura, el autoenfoque y los sistemas de análisis inteligentes automáticos pueden reducir en gran medida los errores en los experimentos para una medición precisa.
2. Principio de inmunoensayo de microlente
La microlente es una lente cilíndrica con un extremo de superficie esférica y el otro extremo es una superficie plana. Tiene un fuerte efecto de amplificación y mejora significativamente la capacidad de imagen del microscopio óptico tradicional . Cuando una microlente con un radio y un índice de refracción (RI) de se sumerge en una solución de () y se ilumina con luz plana, debido al efecto de refracción, su imagen es redonda con un anillo oscuro en su borde . La relación entre el radio del punto brillante de la imagen y otros parámetros como , , , y la altura del cilindro de la microlente se muestra como sigue :donde es el ángulo de incidencia de la luz en la parte superior esférica de la microlente y . Sobre la base de esta fórmula, se pueden determinar los cambios instantáneos del medio midiendo el radio del punto brillante en la imagen y el radio de la microlente. Dado que la refracción óptica tiene lugar a la velocidad de la luz, cualquier variación instantánea de RI en el medio circundante de una microlente puede inducir inmediatamente un cambio en el radio del punto brillante central. Por lo tanto, el método puede controlar el cambio instantáneo de RI/concentración con una cámara de alta velocidad para la obtención de imágenes (Figura 1).
(a)
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(e)
(f)
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3. Estructura y funciones de un instrumento de inmunoensayo con microlentes
Como se muestra en la figura 2, la fuente de luz paralela, la obtención de imágenes de alta resolución, el análisis automático inteligente, el autoenfoque y los sistemas de control de temperatura, y una placa de ensayo con microlentes de varios pocillos componen un instrumento de inmunoensayo con microesferas . Cuando la fuente de luz paralela emite luz paralela a la microlente, el sistema de formación de imágenes de alta resolución con enfoque automático obtiene una imagen enfocada en milisegundos. A continuación, la imagen de la microesfera inmune es analizada por el sistema de software de análisis inteligente para deducir los valores de y así como la concentración de antígeno/anticuerpo. La función del sistema de control de la temperatura es ajustar las diferentes temperaturas necesarias para las distintas reacciones antígeno-anticuerpo. El proceso completo no dura más de 2 minutos.
3.1. Sistema de irradiación de luz paralela
LED como fuente de luz paralela produce un área de iluminación paralela cilíndrica, que es similar a un condensador original con ventajas de bajo coste, largo ciclo de vida, perfecto rendimiento luminoso y pequeña escala . Como se muestra en la figura 3, la luz paralela real se puede recibir debido a la refracción de la lente . En la zona de irradiación del LED, la lente puede cambiar la dirección y la distribución de la luz mediante la configuración de la lente correspondiente, de modo que se obtiene la luz paralela real (Figura 3).
3.2. Sistema de imágenes de alta resolución con enfoque automático
Este sistema consiste en una cámara digital de alta velocidad y un sistema de enfoque automático. En la actualidad, la velocidad de imagen de algunas cámaras digitales comerciales ha superado los 10.000 fotogramas por segundo . Por lo tanto, el sistema de imágenes de alta resolución puede lograr el seguimiento en tiempo real de los cambios dinámicos del RI en la solución. Una cámara CCD de alto número de píxeles desempeña un papel importante en la obtención de imágenes de alta resolución de las microlentes. Los núcleos del sistema de autoenfoque consisten en la identificación de imágenes, el procesamiento de imágenes y las partes de control . Se analizan las imágenes recogidas por el sistema de cámara y se muestra la evaluación de la claridad. De acuerdo con esta evaluación, el sistema es conducido automáticamente a un área o dirección apropiada hasta que la resolución de las imágenes adquiridas satisface el requisito preestablecido.
3.3. Sistema automático inteligente de reconocimiento y análisis de imágenes
El sistema automático inteligente de análisis lleva a cabo principalmente el reconocimiento de imágenes y el análisis de datos en las imágenes de las microlentes con el fin de controlar la variación instantánea de en su imagen y deducir así el cambio de índice de refracción de la solución de la muestra durante el proceso de reacción antígeno-anticuerpo. Su precisión está estrechamente relacionada con la calidad de la imagen, y parámetros como el píxel, el tamaño del píxel y la resolución afectan directamente a la medición del RI . Si se explota la cámara digital CCD con ≥10 millones de píxeles y un tamaño de píxel pequeño que alcanza menos de 3 nm y una microlente con radio de 600 μm, el cambio del índice de refracción se determina por los cambios de la relación del punto brillante central y la relación del radio del anillo exterior, de modo que el cambio del índice de refracción medido puede alcanzar 10-6 .
3.4. Sistema de control de temperatura
El sistema de control de temperatura es una placa de vidrio templado transparente con una fina película de óxido de indio y estaño y controlada por una alta precisión de un controlador de temperatura PID (proporcional-integral-derivativo). Permite que la temperatura de la muestra en la placa de ensayo de microlentes de varios pocillos alcance rápidamente un valor establecido en 2 minutos y se mantenga dentro de un rango de cambio de 0,1°C para que la reacción antígeno-anticuerpo sea efectiva.
3.5. Placa de prueba de microlente
Una placa de microlente de varios pocillos está especialmente diseñada para un instrumento de inmunoensayo de microlente. Está hecha de material de polimetilmetacrilato (PMMA) y se prepara generalmente como 2 o 16 pozos trapezoidales para satisfacer diferentes requisitos de detección. Dentro de cada pocillo hay una microlente con un radio de varios cientos de micras en su parte inferior. La aplicación de la placa de microlentes proporciona una condición objetiva para la detección multicanal. Dado que el diámetro de la parte inferior de los pocillos es de sólo unos 2 mm, bastan varios microlitros de solución de muestra para ahogar la microlente para la detección de antígeno-anticuerpo.
4. Aplicación del sistema de imágenes de microesferas inmunes
4.1. Medición de la reacción antígeno-anticuerpo
Huang y sus colegas detectaron varios tipos de reacciones antígeno-anticuerpo y descubrieron sus características regulares. En primer lugar, el índice de refracción cambió con el tiempo de reacción en el proceso de reacción antígeno (Ag)-anticuerpo (Ab). En segundo lugar, hubo tres fases en la variación del IR con el tiempo de reacción, incluyendo períodos de rápido aumento, relativamente estables y de lento descenso. La primera fase estaba relacionada con la combinación de Ag y Ab, de modo que el RI aumentaba repentinamente con la combinación rápida de Ag y Ab para formar complejos. El máximo de RI se produce en la segunda fase. En tercer lugar, la concentración de Ag o Ab tuvo una gran influencia en el RI. Así, obteniendo el cambio de RI en función de la concentración de Ag o Ab, se puede calcular su contenido en las muestras analizadas mediante la curva de ajuste. En cuarto lugar, los diferentes anticuerpos, como el Ab de captura y el Ab de sondeo, también influirían en la variación del RI. Utilizando esta técnica para medir las reacciones antígeno-anticuerpo mediante varios sistemas Ag-Ab, las relaciones entre el cambio del índice de refracción y las concentraciones de varios tipos de soluciones antígeno-anticuerpo (interferón-γ (IFN-γ) Ag-Ab, Ag-Ab de fosfatasa alcalina de la placenta (PAP), Ag-Ab de calicreína 6 (KLK6), Ag-Ab de gonadotropina coriónica humana (HCG), Ag-Ab de troponina cardíaca (cTnI), Ag-Ab de proteínas de unión de ácidos grasos (FABP) y soluciones de Ag-Ab de proteína C reactiva (CRP)) (Figura 4). Como sabemos que la asociación y disociación del complejo antígeno-anticuerpo es un proceso dinámico, basándonos en la curva de RI vs. tiempo y en el cálculo de la derivada de tiempo y el cálculo de la derivada de con el tiempo, también se puede obtener información sobre las constantes de velocidad de asociación y disociación y (Figura 4(a)) y otros parámetros termodinámicos utilizando la siguiente ecuación
(a)
(b)
(c)
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4.2. Medición de muestras clínicas
La técnica de imagen de microesferas inmunes se utilizó además para analizar muestras clínicas. Se detectaron 36 muestras clínicas mediante ésta para las concentraciones de CRP Ag. Su desviación estándar relativa es de alrededor del 2-10% en comparación con la inmunocromatografía, y el coeficiente de correlación entre los resultados adquiridos por las dos vías alcanza hasta 0,989 (Figura 5). Es bien sabido que las muestras de suero clínicamente hemolizadas pueden afectar en gran medida a la precisión de los resultados detectados mediante los métodos tradicionales. Por el contrario, las imágenes de la microlente en muestras hemolizadas siguen siendo claras mediante esta técnica. Los errores relativos entre los valores de antígenos detectados en las muestras con hemólisis y las que no tienen hemólisis son de apenas un 2%, lo que indica la menor influencia de las muestras de suero hemolizadas en la precisión de los resultados .
5. Viabilidad de la imagen de microesferas inmunes para la detección de antígenos y anticuerpos
La mayoría de los antígenos son proteínas, mientras que unos pocos son polisacáridos, ácidos nucleicos y otras sustancias, y todos los anticuerpos son proteínas. Dado que la proteína contiene una gran cantidad de amido y carboxilo, estos grupos polares hacen que las partículas coloidales produzcan una carga eléctrica debido a la acción electrostática, y las partículas con la misma carga se repelen entre sí . Al mismo tiempo, los grupos polares que son fuertemente hidrófilos reaccionan con las moléculas de agua y forman una capa de hidratación para producir un coloide hidrófilo, asegurando que la proteína no se aglomere para formar un precipitado, de modo que las partículas coloidales se dispersen uniformemente en una solución.
Cuando el antígeno se combina con el anticuerpo, la carga eléctrica de las partículas coloidales se reduce o desaparece, y la capa de hidratación también desaparece o se vuelve fina. La proteína pasa de ser un coloide hidrofílico a hidrofóbico. En el entorno del electrolito, las partículas coloidales se aglomeran aún más para formar los complejos antígeno-anticuerpo que pueden ser realizados por los ojos . Los índices de refracción de los coloides hidrofílicos e hidrofóbicos son notablemente diferentes. Por lo tanto, esta técnica puede controlar los cambios dinámicos del índice de refracción para juzgar si se producen reacciones de antígeno y anticuerpo en una solución. Se puede establecer una curva estándar según una relación entre la concentración de antígeno y anticuerpo y su tiempo de reacción. El complejo se hace más grande con el proceso de reacción antígeno-anticuerpo, y el cambio del índice de refracción también se hace más evidente. Utilizando la curva estándar, es fácil cuantificar la concentración del anticuerpo o antígeno detectado.
Se demostró que un anticuerpo que es complementario a los epítopos de diferentes antígenos induciría efectivamente un incremento similar del IR en la reacción Ag-Ab con el inmunoensayo de imagen de microlentes. Como se muestra en las Figuras 4(b) y 4(c), las mediciones del antígeno se realizaron utilizando Ab de captura y Ab de sondeo o Ab monoclonal y Ab policlonal para un determinado antígeno. A partir de las curvas, podemos ver que no hubo una diferencia significativa entre los dos tipos de anticuerpos en la inducción del cambio durante la reacción Ag-Ab, lo que indica que el inmunoensayo de imagen de microlentes puede utilizar diferentes tipos de anticuerpos, ya sea de captura o de sondeo Ab y monoclonal o policlonal Ab para la detección. Sin embargo, se prefiere el Ab monoclonal para el inmunoensayo de formación de imágenes con microlentes, ya que no sólo induce una mayor reacción por su mayor afinidad con el antígeno, sino que también reduce la posibilidad de falsos positivos por reacción cruzada, de modo que los antígenos pueden detectarse a concentraciones más bajas. En general, la reacción cruzada es teóricamente inevitable para esta técnica, al igual que otros medios implicados en el inmunoensayo. En otras palabras, la especificidad de la imagen de la microlente inmunológica depende completamente de la de los anticuerpos seleccionados contra el antígeno objetivo. Por lo tanto, es muy importante seleccionar los anticuerpos apropiados y optimizar el sistema de reacción Ag-Ab.
6. Conclusiones
Esta técnica de imagen de microlente inmune puede medir rápidamente y con precisión el RI de diferentes muestras y monitorear los cambios en tiempo real del RI en el proceso de reacción del antígeno y el anticuerpo. El RI se altera con los cambios de la concentración del Ag o Ab. Por lo tanto, según el cambio de RI en función de la concentración de Ag o Ab, el contenido de las muestras puede calcularse cualitativa y cuantitativamente sin necesidad de etiquetado, premodificación, poslavado y costosas enzimas. En comparación con los métodos de detección convencionales, las ventajas de este método son la precisión, la fiabilidad, la rapidez (finalización en varios minutos) y la sencillez sin contaminación. Además, su límite de detección es tan bajo como pg/ml, que sólo requiere varios μl suficientes para realizar la detección y también es adecuado para muestras clínicas hemolizadas que son difíciles de detectar con los métodos tradicionales. Además, no es intrusivo para las muestras. El sistema de irradiación de luz en paralelo, el sistema de cámara de alta resolución, el sistema de análisis inteligente automático, el sistema de autoenfoque, el sistema de control de temperatura y la placa de detección de microlentes porosas componen el instrumento de inmunoensayo de microesferas. Es pequeño y fácil de transportar.
Es bien sabido que la reacción antígeno-anticuerpo está muy influenciada por su propia concentración, temperatura, pH y solución electrolítica. Por esta razón, estos factores se tienen en cuenta en el sistema de imágenes de microlentes para mantener los datos estables mediante el equilibrio de sus cambios. Por ejemplo, este sistema puede optimizarse seleccionando materiales adecuados para una placa de prueba que ofrezca un sitio de reacción antígeno-anticuerpo y haciendo que la placa sea hidrofílica para evitar interferencias hidrofóbicas. La precisión de la detección puede mejorarse aún más ajustando la proporción antígeno-anticuerpo, seleccionando el diluyente adecuado, modificándolo con iones metálicos, etc.
La detección de antígenos y anticuerpos es relativamente importante en los campos de la investigación biomédica, el diagnóstico clínico, el análisis de fármacos, la seguridad alimentaria y la vigilancia medioambiental. Con la preocupación de la gente por la salud ambiental, la seguridad alimentaria y la asistencia sanitaria, el desarrollo de un instrumento sensible con bajo coste, alta precisión, pequeño tamaño, portabilidad y operación simple se ha convertido en una necesidad social urgente. Por lo tanto, esta técnica de imagen de microlentes inmunes es prometedora para ser ampliamente aplicada a varios campos y apropiada para ser especialmente popularizada en la comunidad y el campo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.
Contribuciones de los autores
Jiahui Liang y Xiaotian Ye contribuyeron a partes iguales a este trabajo.
Agradecimientos
Agradecemos al Programa de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou Proyecto Principal de Innovación Sinérgica (número de subvención: 201604020146) y a la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención: 81172824 y 30971465) por su apoyo financiero.