By Elizabeth Burke

Tuesday, August 9, 2016

Wetenschappers gebruiken een verscheidenheid aan laboratoriumtechnieken om de genetische oorzaak van menselijke ziekten te onderzoeken. Bij onderzoek wordt vaak gebruik gemaakt van cellen of weefselmonsters van patiënten, maar om te bepalen of een mutatie in een specifiek gen de symptomen van een patiënt kan veroorzaken, hebben we vaak experimentele diermodellen nodig.

Waren muizen en ratten in het verleden gangbare keuzes voor het modelleren van menselijke ziekten, het gebruik van zebravissen wint snel aan populariteit. Verbaast u dat?

Wat zijn zebravissen?

Zebravissen zijn tropische zoetwatervissen van de familie der minnetjes. In het wild komen ze voor in rivieren en vijvers van India, maar ze zijn nu ook vaak verkrijgbaar in dierenwinkels. De naam “zebravis” komt van de horizontale blauwe strepen aan weerszijden van hun lichaam.

Zebravissen, zo genoemd vanwege hun strepen, leven bij voorkeur in grote groepen die scholen worden genoemd.

Hoe kun je een menselijke ziekte modelleren in vissen?

Hoewel mensen heel anders lijken dan zebravissen, lijken wij eigenlijk veel meer op hen dan je zou denken. In feite wordt 70% van de menselijke genen gevonden in zebravissen.

Meer nog, zebravissen hebben twee ogen, een mond, hersenen, ruggenmerg, darm, alvleesklier, lever, galwegen, nieren, slokdarm, hart, oor, neus, spieren, bloed, botten, kraakbeen, en tanden. Veel van de genen en cruciale paden die nodig zijn om deze kenmerken te kweken, zijn in hoge mate geconserveerd tussen de mens en de zebravis. Daarom kan elke ziekte die bij de mens veranderingen in deze lichaamsdelen veroorzaakt, theoretisch in de zebravis worden gemodelleerd.

Waarom zebravissen gebruiken als je ook muizen kunt gebruiken?

Terwijl muizen evolutionair meer op de mens lijken omdat het zoogdieren zijn, hebben zebravissen verschillende voordelen ten opzichte van hun harige concurrenten.

Een belangrijk voordeel van zebravissen is dat de volwassen dieren klein zijn en bij voorkeur in grote groepen, of “scholen”, worden gehuisvest. Daardoor hebben ze veel minder ruimte nodig en zijn ze goedkoper te onderhouden dan muizen.

De NIH Zebrafish Core huisvest honderdduizenden zebravissen in een ultramoderne faciliteit.

Een ander voordeel is dat volwassen zebravissen zich snel voortplanten (ongeveer elke 10 dagen) en wel 50 tot 300 eitjes per keer kunnen produceren. Dit is heel wat anders dan bij muizen, die over het algemeen nesten van één tot tien jongen voortbrengen en in hun leven slechts ongeveer drie nesten kunnen krijgen. Wetenschappelijke experimenten worden over het algemeen meerdere malen herhaald om te bewijzen dat de resultaten accuraat zijn, dus het hebben van een dier dat keer op keer een groot aantal nakomelingen kan produceren is nuttig.

Zebravisembryo’s worden ook uitwendig gelegd en bevrucht, waardoor ze gemakkelijk op verschillende manieren kunnen worden gemanipuleerd. Indien nodig kan in-vitrofertilisatie worden uitgevoerd. De in één celstadium bevruchte eitjes kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd met DNA of RNA om hun genetische opmaak permanent te wijzigen en zo transgene of knock-out zebravislijnen te genereren. Het werken met muizen op deze manier is veel gecompliceerder. Muizenembryo’s ontwikkelen zich in de moeder, en om ze te bereiken en te manipuleren zou de moeder moeten worden opgeofferd. Om de embryo’s in leven te houden nadat ze zijn bevrucht of geïnjecteerd, zouden ze ook in een andere vrouwelijke muis moeten worden getransplanteerd.

Zebravislarven, het ontwikkelingsstadium tussen drie en dertig dagen na de bevruchting, groeien in lengte van ongeveer 3,5 tot 8 millimeter.

Daarenboven zijn zebravisembryo’s helder, waardoor wetenschappers de bevruchte eitjes onder een microscoop kunnen zien uitgroeien tot volledig gevormde babyvisjes. Hun transparantie maakt het ook mogelijk om fluorescent gelabelde weefsels in transgene zebravisembryo’s te visualiseren. Muisembryo’s zijn niet doorzichtig en ontwikkelen zich in de moeder, zodat de observatie van de ontwikkeling van levende embryo’s zoals bij zebravissen niet mogelijk is.

Echter, er is een grens aan de soorten ziekten die in zebravissen kunnen worden bestudeerd. Menselijke ziekten die worden veroorzaakt door genen die niet in de zebravis voorkomen, vereisen een ander diermodel. Bovendien zijn zebravissen geen bruikbare modellen voor ziekten bij de mens die voornamelijk plaatsvinden in een weefseltype of lichaamsdeel dat de zebravis niet heeft (b.v. prostaat, borstklieren, longen).

Hoe gebruikt u zebravissen precies om ziekten bij de mens te onderzoeken?

Vaak wordt het DNA van een patiënt gesequenced om een mutatie te vinden in een gen dat mogelijk de oorzaak is van zijn of haar ziekteverschijnselen. Om te bepalen of functieverlies van dat gen de symptomen bij de patiënt kan veroorzaken, wordt hetzelfde gen bij zebravissen gemuteerd of “uitgeschakeld”, waarna de vissen op soortgelijke symptomen worden onderzocht. Hoewel het veel moeilijker is om dit te doen, kan de exacte mutatie die de patiënt heeft ook in de zebravis worden ingebracht – dit wordt een “knock-in” genoemd.

Als een of meer van de symptomen van de patiënt worden waargenomen in het zebravis knock-out of knock-in model, kan de zebravis worden gebruikt voor verdere studies om te helpen bepalen waarom de mutatie in dat gen de ziekte veroorzaakt. Zo kan bijvoorbeeld de structuur van de spiervezels onder de microscoop worden onderzocht op afwijkingen als de patiënt een spierziekte heeft. Of als de ziekteverschijnselen van de patiënt begonnen tijdens de ontwikkeling in de baarmoeder, kunnen knock-out of knock-in zebravis embryo’s worden onderzocht op genexpressie veranderingen (vergeleken met embryo’s zonder de mutatie) die zouden kunnen leiden tot een abnormale ontwikkeling. Voor een patiënt met een neurologische aandoening kunnen de neuronen van knock-out embryo’s fluorescent gelabeld worden om te zien of ze zich verkeerd vormen.

Naast het gebruik van zebravis-ziektemodellen om menselijke ziekten te karakteriseren, kunnen onderzoekers ook nieuwe geneesmiddelen identificeren en testen om de gemodelleerde ziekten te behandelen. Het vermogen van zebravissen om veel embryo’s te genereren elke keer dat ze zich voortplanten, maakt ze bijzonder nuttig voor high throughput drug screening.

Wat zijn enkele voorbeelden van menselijke ziekten die met succes in zebravissen zijn gemodelleerd?

Het genereren van een knock-out van het dystrofine-gen in zebravissen blijkt sterk te lijken op de ernst en progressie van de menselijke ziekte Duchenne spierdystrofie. Patiënten met Duchenne spierdystrofie blijken mutaties in dystrofine te dragen en vertonen als kind spierzwakte die progressief verergert. Zowel bij de mens als in het zebravismodel leidt het verlies van dystrofine geleidelijk tot necrotische spiervezels die worden vervangen door ontstekingscellen, fibrose en abnormaal grote spiervezels.

Deze figuur toont visuele verschillen in spieren tussen wild-type zebravislarven (A, B, C) en distrofische larven (A’, B’, C’). Bron: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Humaan melanoom is ook met succes gemodelleerd in zebravis. De meest voorkomende mutatie in menselijke melanomen – een verandering van één aminozuur in het gen BRAF – werd in de zebravis aangebracht om een knock-in model te maken. Aangezien kankers worden veroorzaakt door een combinatie van verschillende genetische veranderingen, werd deze knock-in zebravislijn gebruikt om andere potentiële kankerveroorzakende mutaties te screenen. Toen een andere veel waargenomen melanoommutatie van het gen SETDB1 werd toegevoegd aan de BRAF knock-in zebravis, ontwikkelde zich snel een melanoom. Deze resultaten hebben geholpen om vast te stellen dat SETDB1 een belangrijk gen is bij de groei van melanomen.

Dergelijke voorbeelden van hoe mensen en zebravissen dezelfde ziekte kunnen manifesteren ondanks hoe verschillend we lijken, maken het gemakkelijk te begrijpen waarom zebravissen een goed aanvaard diermodel aan het worden zijn. Hier in het NIH Undiagnosed Diseases Program, voeren we studies uit met zebravissen als een van verschillende benaderingen om de mogelijke betrokkenheid van veranderde genen in de uiterst zeldzame ziekten van onze patiënten te onderzoeken. Terwijl muizen in het verleden de belangrijkste dierlijke brug vormden tussen het laboratorium en het bed, hebben recente studies het potentieel van de zebravis aangetoond om te dienen als een tractabel alternatief voor muizen. De timing van de adoptie van de zebravis als een opkomend modelorganisme kon niet beter zijn, aangezien muisstudies vaak niet vertaald kunnen worden naar de mens. Hoewel geen enkel dier een menselijke ziekte perfect kan modelleren, geloof ik dat deze kleine gestreepte zwemmers een groot potentieel hebben om medisch onderzoek in de toekomst te bevorderen.

Om meer te weten te komen over hoe zebravissen bijdragen aan biomedische wetenschap en menselijke gezondheid, bezoek de websites voor de Trans-NIH Zebrafish Initiative website en de NICHD Zebrafish Core.