DR. EDWIN B. ASTWOOD was een visionair in de moderne endocrinologie. De Biografische Herinnering van Roy Greep en Monte Greer eindigt met “Naast zijn specifieke onderzoeksbijdragen is Dr. Edwin B. Astwood er in een mate die weinigen hebben bereikt in geslaagd het brede gebied tussen natuurwetenschappen en klinische geneeskunde te overbruggen.” Voor mij is dit de hoogste roeping in de endocrinologie.

De late jaren zestig en vroege jaren zeventig werden gekenmerkt door de ongelooflijke prestaties van twee groepen, die van Drs. Andrew Schally en Roger Guillemin, die de regulerende hormonen van de hypothalamus isoleerden, karakteriseerden en van een sequentie voorzagen. Het eerste hypothalamus regulerende hormoon dat werd gesequenced was TRH (een tripeptide), het tweede was gonadotropin-releasing hormone (een decapeptide), en het derde was somatostatine met 14 aminozuren. Het bestaan van het GHRH was in het begin van de jaren zestig gesuggereerd door enkele klassieke experimenten van Reichlin (1); hij maakte laesies in de hypothalamus en toonde aan dat het gehalte aan GH in de hypofyse afnam. Op basis van deze gegevens suggereerde hij dat er een GHRH in de hypothalamus moet zijn.

Ik deed mijn medische opleiding in Londen, Engeland, met mijn endocriene opleiding onder Prof. G. Michael Besser. Een van de leukste conferenties die we regelmatig bijwoonden was de presentatie van klinische gevallen in de Royal Society of Medicine. In mijn geheugen gegrift stond het feit dat telkens wanneer een patiënt met acromegalie werd voorgesteld, Prof. Peter Sonksen vroeg of de patiënt al dan niet aanwijzingen had voor een carcinoïde tumor. De perceptie in het publiek was “Waarom stelt deze man altijd deze vraag?” omdat dergelijke gevallen waarschijnlijk niet bestaan of, zo ja, zeer zelden!

In 1977 verhuisde ik van het St. Bartholomew’s Hospital (Londen, Engeland) naar de Universiteit van Virginia. Mijn voornaamste belangstelling ging toen uit naar PRL afscheidende hypofysetumoren en hun medische behandeling.

In oktober 1980 werd een 21-jarige patiënte naar mij verwezen door Dr. Ann Johanson. Deze patiënte had amenorroe en galactorroe terwijl ze een oraal voorbehoedsmiddel nam voor gonadale steroïdenvervanging. Ze had gonadale agenese door het syndroom van Turner.

Haar evaluatie toonde een vergrote hypofyse fossa op schedel röntgenfoto’s, een hypofyse massa met bescheiden suprasellaire uitbreiding op computertomografie scan, en een verhoogd serum PRL van 68 μg/L. Haar verhoogde serum GH van 95 μg/L werd niet onderdrukt met orale glucose, verhoogd met TRH, en onderdrukt met een dopamine-infuus. Haar serum insuline-achtige groeifactor (IGF)-I niveau was verhoogd met 11 U/mL (normaal, 0,41-2,2 U/mL).

Gebaseerd op deze resultaten, was de diagnose van acromegalie duidelijk. Het is van belang dat de patiente 1,80 m lang was, wat erg lang is voor een patiente met het syndroom van Turner. In dit verband was het een geluk dat sera waren bewaard van de voorgaande 7 jaar. Haar serum GH-concentraties waren gedurende die periode verhoogd (tabel 1).

De patiënte werd doorverwezen voor een transsfenoïdale operatie, die werd uitgevoerd op 15 januari 1981. Zeven weken na de operatie bleek ze nog steeds acromegalie te hebben; serum GH was 52 μg/L, en IGF-I was nog steeds verhoogd met 7,7 U/mL.

Als onderdeel van een voortdurende samenwerking waren de hypofyse-pathologie specimens verzonden naar Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Canada). Enige tijd later belde Dr. Kovacs om mij de resultaten van zijn onderzoek van het weefsel mede te delen. Zijn rapport gaf aan dat deze patiënt somatotrofe hyperplasie had en geen hypofysetumor. De redenen die tot deze diagnose leidden waren: 1) het reticulinepatroon was bewaard gebleven (het wordt vernietigd in tumoren) (Fig. 1); 2) somatotrofen overheersten, hoewel thyrotrofen, gonadotrofen, en corticotrofen werden afgewisseld; en 3) elektronenmicroscopie van de somatotrofen toonde goed ontwikkeld endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat, wat wijst op actieve hormoonsynthese (Fig. 2). Omdat de somatotrofen dicht opeengepakt waren met secreterende granules, suggereerde dit voor mij dat dit de remming van hormoonafgifte weerspiegelde als gevolg van terugkoppeling van afgescheiden GH, vermoedelijk door verhoging van de somatostatine secretie (en/of IGF-I).

Gebaseerd op hypofyse histologie, was het duidelijk dat de hypofyse werd gestimuleerd door een extrinsieke factor. Het was onwaarschijnlijk dat dit te wijten was aan een mutatie in de GHRH-receptor of een constitutieve activering van het G-eiwit gekoppeld aan de GHRH-receptor, omdat dit waarschijnlijk in een enkele cel zou optreden, wat zou leiden tot tumorontwikkeling en de afbraak van het reticulinepatroon. Daarom was het veel waarschijnlijker dat de hypofyse werd gestimuleerd door een extrinsieke factor, hetzij GHRH afkomstig van de hypothalamus of uit de periferie. Ten tweede maakte de aanhoudende acromegalie het noodzakelijk dat we de oorzaak van de acromegalie van deze patiënt zouden vinden. In die tijd meldde een artikel van Frohman et al. (2) de gedeeltelijke zuivering en karakterisering van een peptide met GH-afgevende activiteit uit extrapituitaire tumoren van acromegalische patiënten.

Een abdominale computertomografie-scan toonde een tumor met een diameter van 5 cm in de staart van de pancreas. Op 26 augustus 1981 werd de tumor verwijderd. Hij was goed ingekapseld en bij histologie werd vastgesteld dat het een islet celtumor was. De tumor was echter noch een β noch een α celtumor. Het was sterk positief voor neuron-specifiek enolase, en op immunokleuring was negatief voor GH, insuline, glucagon, calcitonine, en ACTH, met onduidelijke kleuring voor somatostatine.

De tumor bevatte geen GH door immunocytochemie. In de eerste 2 uur na het verwijderen van de tumor was er een snelle daling in serum GH niveaus van 70 μg/L tot 3 μg/L (Fig. 3) (3). De patiënte wordt nu 18 jaar gevolgd en is nog steeds genezen van haar acromegalie.

De volgende vraag was wat te doen met de alvleeskliertumor. In die tijd had ik het geluk om wijlen Dr. Michael Cronin als collega te hebben aan de Universiteit van Virginia. Michael kwam met mij naar de operatiekamer om te helpen bij de uitvoering van onze zorgvuldig uitgekiende strategie voor de behandeling van de tumor. De helft van de tumor werd in blokjes gesneden en onmiddellijk in vloeibare stikstof gebracht, en de andere helft werd voorbereid voor weefselkweek. De laatste helft werd naar verschillende groepen gestuurd die experts waren in het maken van stabiele cellijnen. Michael Cronin kon aantonen dat het medium waarin deze tumor baadde GHRH activiteit bevatte en adenylaat cyclase stimuleerde (4). De tumor werd aanvankelijk ter beschikking gesteld aan Dr. Wylie Vale van het Salk Instituut (La Jolla, CA), en hij gaf vervolgens een deel ervan aan Dr. Guillemin. De twee groepen ontdekten onafhankelijk van elkaar dat de tumor een hoge GHRH activiteit bevatte en waren in staat het GHRH uit de tumor te isoleren, te karakteriseren en van een sequentie te voorzien (5-8). GHRH uit deze tumor was een 40-aminozuur peptide, dat homologie vertoont met leden van de glucagon/secretine/VIP familie van peptiden.

Ik koos endocrinologie als mijn specialisme omdat mijn mentoren mij het belang hebben ingeprent van de toepassing van de fysiologie op het begrijpen van de pathofysiologie en de therapie van patiënten met endocriene ziekten.

Elke patiënt die men ziet is een experiment van de natuur. Ik had het geluk te worden doorverwezen naar deze patiënt die mij en mijn collega’s in staat stelde de tumor te leveren aan twee toonaangevende groepen die vervolgens in staat waren het lang gezochte GHRH te isoleren, te karakteriseren en te sequensen. In feite was GHRH een van de eerste hypothalamushormonen waarnaar werd gezocht, maar er waren veel valse starts geweest.

Er waren verschillende redenen waarom het in 1982 mogelijk was om GHRH met succes te karakteriseren en te sequentiëren. Ten eerste waren de methoden voor de beoordeling van de activiteit van tumorextracten verfijnd en veel gevoeliger geworden. Ten tweede waren de methoden voor microsequencing sterk verbeterd in de voorgaande 10 jaar. Maar de derde, en waarschijnlijk de belangrijkste, reden was dat deze tumor hoge concentraties GHRH bevatte en zeer weinig somatostatine. Somatostatine remt de GH-afgifte in de bioassay, zodat de aanwezigheid ervan het toezicht op de zuivering van GHRH bemoeilijkte. Het extract van deze tumor vereenvoudigde het proces aanzienlijk (omdat het hoge concentraties GHRH had en er weinig somatostatine aanwezig was), vergeleken met eerdere pogingen waarbij honderdduizenden dierlijke hypothalami werden gebruikt die rijk waren aan somatostatine en zeer kleine concentraties GHRH hadden. Dit was het eerste voorbeeld waarbij een enkele menselijke tumor werd gebruikt om een hormoon te identificeren en te isoleren. PTH-verwant eiwit werd geïsoleerd met een soortgelijke techniek met behulp van een menselijke tumor cellijn.

Als clinici hebben we allemaal de verantwoordelijkheid om experimenten van de natuur te identificeren en de kansen aan te grijpen om vragen te stellen die op een andere manier zeer moeilijk te beantwoorden zouden zijn. De experimenten van de natuur zijn vaak uniek, en zeker de 15 of 20 patiënten die voor deze kwamen gaven aanwijzingen dat een tumor van een patiënt met ectopische GHRH secretie de vraag naar de aard en structuur van GHRH zou kunnen beantwoorden. In feite werd de groep van Dr. Guillemin zich later bewust van een andere tumor van Dr. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Frankrijk), en aangezien zij meer weefsel van die tumor hadden, bestudeerden zij deze agressiever dan de tumor uit Charlottesville. Het was echter de oorspronkelijke tumor uit Charlottesville die suggereerde dat een dergelijke tumor de sleutel zou kunnen bieden tot de zoektocht naar GHRH.

De daaropvolgende studie van de fysiologie van GHRH en zijn therapeutisch potentieel als behandeling voor GH-deficiëntie bij kinderen is de focus geweest van het werk van onze groep gedurende de laatste 17 jaar (9, 10). In eerste instantie hebben we GHRH toegediend aan normale vrijwilligers en de werkzaamheid en specificiteit in het verhogen van serum GH concentraties aangetoond (11). Vervolgens hebben wij de GH respons op een acute injectie van GHRH bepaald bij kinderen met idiopathische GH deficiëntie (Fig. 4). Bij veel van de kinderen was er een zeer sterke stijging van de GH, terwijl er bij sommige kinderen een kleine of geen stijging was (12); de respons op GHRH was groter dan op arginine en l-dopa. Op basis van deze resultaten stelden wij voor dat veel kinderen met idiopathische GH-deficiëntie werkelijk lijden aan GHRH-deficiëntie.

Een multicenter trial van GHRH-behandeling werd toen gestart. Dit leek bijzonder geschikt omdat de GH die werd gebruikt om GH-deficiëntie te behandelen, afkomstig was van kadavers en betrokken was geweest bij de overdracht van de ziekte van Jacob Creutzfeld. In totaal werden 24 kinderen behandeld; bij 10 kinderen werd een pomp gebruikt om elke 3 uur een sc GHRH bolus toe te dienen. Deze route en dosis werden gekozen om de normale fysiologie van ongeveer één GH puls elke 3 uur bij opgroeiende kinderen na te bootsen. Daarnaast werden 10 kinderen alleen ’s nachts met de pomp om de 3 uur behandeld, en 4 kinderen kregen tweemaal daags sc injecties met GHRH. De groeisnelheden bij de kinderen vóór en na 6 maanden behandeling worden getoond in Fig. 5 (13).

Gebaseerd op de resultaten van deze studie, startte Serono Laboratories, Inc. een 12 maanden durende multicenter studie met GHRH(1-29)-NH2 eenmaal daags toegediend sc (14). De kinderen die het langzaamst groeiden hadden de grootste toename in groeisnelheid (Fig. 6). Dit suggereert dat GHRH de fysiologische GH secretie kan herstellen. GHRH is door de Food and Drug Administration goedgekeurd voor diagnostisch gebruik, alsmede voor de behandeling van GH deficiëntie bij kinderen. GHRH is veilig en versnelt effectief de groeisnelheid bij de meerderheid van GH-deficiënte patiënten.

Toen GHRH werd gesynthetiseerd was er veel belangstelling voor de down-regulatie van de gonadotropine respons op het gonadotropine-releasing hormoon. Wij waren geïntrigeerd door een observatie bij een andere patiënt met ectopische GHRH secretie van een metastatische carcinoïde tumor die aanleiding gaf tot acromegalie. Ondanks aanhoudend verhoogde GHRH niveaus gedurende de 24-uurs periode, was het patroon van GH-afgifte nog steeds pulsatiel, wat aangeeft dat er vermoedelijk andere factoren betrokken zijn bij het reguleren van het pulsatiele patroon van GH-afgifte (15). Er is gesuggereerd dat dit het gevolg zou kunnen zijn van de terugtrekking van somatostatine. Aldus toont ectopische GHRH secretie ondubbelzinnig aan dat een langwerkende GHRH agonist de pulsatiele GH secretie kan verhogen. Continue iv GHRH infusie studies bij normale proefpersonen tonen hetzelfde fenomeen aan, en het is dus duidelijk dat een depot preparaat van GHRH een bruikbaar therapeutisch middel kan zijn.

Onze groep (16) en Mayo (17) hebben de GHRH receptor gekloond. Het is interessant dat de GHRH-receptor behoort tot de B-klasse van G-eiwitgekoppelde receptoren, waartoe ook de receptoren voor de glucagon/secretine-familie van peptiden behoren, evenals CRH, calcitonine en bijschildklierhormoon. Hun structuur is totaal verschillend van die van de grotere rhodopsine-receptoren (A-familie). Er zijn echter ook zeven transmembraan-overspannende domeinen in deze familie van receptoren.

De kritieke rol van GHRH wordt aangetoond door de dwerg lit muis die een puntmutatie in de GHRH receptor heeft (18, 19). Wajnrajch et al. (20) beschreven een nonsense mutatie (Glu 72stop) in de menselijke GHRH receptor die groeistoornissen en GH-deficiëntie veroorzaakte bij twee kinderen van dezelfde Indiase Moslim afstamming. Maheshwari et al. (21) hebben een bloedverwantschap beschreven in de Vallei van Sindh in Pakistan met dezelfde mutatie. Leden van deze stam zijn extreem klein van gestalte. Een andere mutatie in de receptor is beschreven in een grote Braziliaanse bloedlijn met meer dan 110 personen met een ernstig tekort aan GH en een extreem korte gestalte (22). Deze experimenten van de natuur tonen aan dat een defect in de GHRH receptor de normale groei belemmert en benadrukt het vitale belang van GHRH.

Een cartoon van de GHRH receptor is afgebeeld in Fig. 7 (10). Asparaginezuur op positie 60 van het startcodon is de plaats van de ontstoken muis mutatie. Western blotting met een C-terminaal GHRH receptor antiserum dat is opgegroeid tegen een peptide gebaseerd op de sequentie van de menselijke GHRH receptor is gebruikt om membranen van HEK293 cellen, getransfecteerd met complementair DNA voor de GHRH receptor, te bestuderen. De studies geven aan dat de lit muis receptor wordt vertaald in eiwit en daadwerkelijk aanwezig is in het membraan van hypofysecellen in de lit muis. Wij hebben voorgesteld dat deze mutatie leidt tot een verandering in de tertiaire structuur van de receptor, die binding verhindert (23). Met behulp van foto affiniteit probes, ons bewijs suggereert dat andere sites zijn in de nabijheid van gebonden GHRH, wat erop wijst dat verschillende sites van interactie zijn waarschijnlijk vereist voor signaaltransductie. De beschikbaarheid van recombinante receptoren maakt het zoeken naar niet-peptide GHRH agonisten haalbaar.

Concluderend, kennis verzameld uit zorgvuldige observatie van een enkele patiënt met acromegalie leidde tot de isolatie, karakterisering, en synthese van GHRH. Aanvullende studies leidden tot de introductie van GHRH voor de behandeling van GH-deficiëntie. Vervolgens waren wij en anderen in staat de receptor voor GHRH te klonen. Studies met GHRH hebben bevestigd dat het essentieel is voor GH synthese en normale groei. Dit standpunt wordt nu bevestigd door de waarnemingen dat mutaties van de GHRH-receptor, die leiden tot inactivering ervan, leiden tot ernstige GH-deficiëntie en ernstige klein gestalte en de cirkel van ons begrip van GH-regulatie door GHRH rondmaken.