Abstract

Chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV) is een ernstige ziekte met ongewone EBV activatie die jaren aanhoudt, en de pathogenese is grotendeels onbekend. Na de creatie van een accuraat en reproduceerbaar polymerase kettingreactie systeem om EBV DNA te kwantificeren, werd de virusbelasting in perifere bloed lymfocyten (PBL) bepaald bij 54 kinderen: 15 met CAEBV, 16 met infectieuze mononucleosis (IM), en 23 gezonde kinderen. Kinderen met CAEBV en die met IM hadden hoge virusbelastingen. Lagere ladingen werden gedetecteerd in 47% van de seropositieve gezonde donoren. Er waren twee duidelijke verschillen tussen kinderen met CAEBV en die met IM: De eerstgenoemden hadden een grotere virale replicatie (103-107 kopieën/PBL)2.5 × 105 PBL) dan degenen met IM, en de virale replicatie nam af bij kinderen met IM terwijl actieve replicatie jarenlang aanhield bij personen met CAEBV. Aanhoudend hoge virusbelastingen zijn een mogelijk diagnostisch criterium voor CAEBV. EBV-belastingen kunnen classificatie en prognose van EBV-infecties mogelijk maken.

Epstein-Barr virus (EBV) is een veroorzaker van infectieuze mononucleosis (IM) en van chronische actieve EBV-infectie (CAEBV). CAEBV is een ernstige ziekte met ongewone EBV-activatie die fataal kan zijn met meervoudig orgaanfalen, en het wordt geassocieerd met maligne lymfoom zonder voorafgaande immunosuppressie . De klinische symptomen van EBV en de serologische afwijkingen die overeenkomen met actieve EBV-replicatie, zoals een duidelijk verhoogd anti-EA-DR antilichaam en afwezigheid van Epstein-Barr nucleair antigeen (EBNA) antilichaam, houden maanden tot jaren aan. EBV vermenigvuldigt zich in NK-, T- en B-cellen.

Zodra de infectie is vastgesteld, verblijft EBV gewoonlijk levenslang in B-lymfocyten zonder klinische symptomen te veroorzaken (aangeduid als een latente infectie). Daarom is niet alleen de detectie maar ook de kwantificering van EBV in aangetaste weefsels essentieel om EBV ziekte te onderzoeken.

Om de status van EBV replicatie in personen met CAEBV te verduidelijken, gebruikten we semikwantitatieve DNA polymerase kettingreactie (PCR) om de virusbelasting in perifere bloedlymfocyten (PBL) in 3 groepen kinderen te evalueren en te vergelijken: één met CAEBV, één met IM, en gezonde controles. Ons detectiesysteem werd beschouwd als accuraat en betrouwbaar voor de kwantificering van EBV omdat we een single-copy regio van EBV hebben geamplificeerd. De meeste eerdere studies richtten zich op de BamHI-W regio waarvoor de tandem repeat reiteratie frequentie niet constant is. Wij geloven dat deze studie de eerste en grootste studie is van de virusbelasting in PBL van kinderen met CAEBV.

Materialen en Methoden

Patiënten en controles

We onderzochten 16 kinderen met IM (11 jongens, 5 meisjes; leeftijden, 0-8 jaar), 15 met CAEBV (11 jongens, 4 meisjes; leeftijden, 4-19 jaar), 19 immunocompetente EBV-seropositieve gezonde personen (10 jongens, 9 meisjes; leeftijden, 1-19 jaar), en 4 seronegatieve gezonde kinderen (3 jongens, 1 meisje; leeftijden, 1-10 jaar). Alle personen met IM vertoonden typische klinische verschijnselen (bv. koorts, tonsillitis, lymfadenopathie, hepatosplenomegalie, leverfunctiestoornissen en atypische lymfocytose). De diagnose IM werd gesteld op basis van serologische bevindingen van IgM-antilichaam tegen viraal capsid antigeen (VCA) of seroconversie van VCA IgG en/of EA en negatief EBNA-antilichaam. Tweeëntwintig bloedmonsters werden genomen bij 16 kinderen met IM 8 dagen tot 8 maanden na het begin van de ziekte (het eerste symptoom was koorts bij alle patiënten). CAEBV werd gediagnosticeerd volgens de criteria van Rickinson. Kinderen met CAEBV hadden intermitterende of aanhoudende koorts gedurende >16 maanden, met hepatosplenomegalie, lymfadenopathie, en/of huiduitslag. De laboratoriumresultaten toonden verhoogde transaminasespiegels, anemie, trombocytopenie, en/of polyklonale hypergammaglobulinemie. Serologisch onderzoek toonde een duidelijke verhoging van de antilichaamtiters tegen VCA en EA. Humane immunodeficiëntie virusinfectie en reumatische aandoeningen werden uitgesloten. Geen van de proefpersonen had een transplantatie ondergaan of antikankertherapie ondergaan.

Stalen

Geepariniseerde 2-mL perifere bloedmonsters werden verzameld. PBL werden geïsoleerd met ficoll-hypaque en gelyseerd met 0,15 μg/μL proteinase K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA werd geëxtraheerd met fenol-chloroform-ethanol precipitatie. Het geëxtraheerde DNA werd gekwantificeerd met een spectrofotometer, aangepast tot 0,25 μg/μL DNA, en gebruikt als de PCR-sjablonen.

PCR gevoeligheid

EBV DNA waren afkomstig van drie bronnen: Raji, met 50 kopieën EBV per cel ; Akata, met 20 kopieën per cel; en gekloonde BamHI-L fragmenten, die werden vermengd met DNA van navelstrengbloedcellen en gebruikt als positieve standaard. Om de gevoeligheid van het PCR-systeem te bepalen, werden seriële 10-voudige verdunningen (10°-104 kopieën EBV) van het geëxtraheerde DNA onderworpen aan PCR.

PCR

Een geneste dubbele PCR werd ontworpen om de geconserveerde regio die codeert voor gp220 (binnen het BamHI-L fragment) te amplificeren. Het buitenste primerpaar amplificeert een fragment van 302 bp, met behulp van de oligonucleotiden 5′-GCGAACTGGTGGACACATGA en 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, overeenkomend met posities 2870-3171 van B95-8 (GenBank M10593). Het binnenste paar amplificeert een fragment van 239 bp. De PCR werd uitgevoerd in een reactie van 50 μl met 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM van elke primer, 2,5 U Taq DNA-polymerase (Boehringer-Mannheim), en 4 μL DNA-monster. De geamplificeerde producten werden uitgevoerd op 2% agarose en gekleurd met ethidiumbromide, en Southern blotting werd gebruikt om de specificiteit te bevestigen met behulp van het BamHI-L fragment als een probe . Elke PCR-reactie werd in drievoud uitgevoerd en omvatte de negatieve controle om kruisbesmetting uit te sluiten. Om de specificiteit van de PCR te bevestigen, werd DNA geanalyseerd van herpes simplex virus types 1 en 2, varicella-zoster virus, humaan cytomegalovirus, en humane herpesvirussen-6 en -7. Er werd geen specifieke amplificatie waargenomen.

Kwantificering van EBV-genoom

De hoeveelheid EBV-DNA in PBL werd bepaald door limiterende verdunningsexperimenten. Seriële 10-voudige verdunningen (1-10-6μg) van genomisch DNA geëxtraheerd uit elk monster DNA werd onderworpen aan de geneste PCR zoals hierboven beschreven, en de minimale limiet voor het positieve resultaat werd omgezet in de virusbelasting (kopieën/2.5 × 105 cellen).

Resultaten

De gevoeligheid van het PCR-systeem werd zorgvuldig bepaald door 10-voudige verdunningen van de drie bronnen van EBV DNA: Raji en Akata, die beide constante aantallen kopieën van EBV DNA per cel bevatten, en het gekloonde BamHI-L fragment. Raji bevat 50 kopieën van EBV-genoom per cel , en 1 ug van genomisch DNA van Raji-cellen is gelijk aan dat geëxtraheerd uit 2,5 × 105 cellen: dus 1,25 × 107 kopieën van EBV DNA. Het DNA van Raji werd op passende wijze verdund, en DNA met 10n kopieën (seriële verdunningen van 10°-104 kopieën van het virus) werd aan amplificatie onderworpen. De minimale grens voor een positief PCR-resultaat werd onderzocht. Uit herhaalde onderzoeken bleek dat de gevoeligheid 100 kopieën per reactie bedroeg met reproduceerbaarheid. De resultaten waren hetzelfde met Akata DNA en met het verdunningsexperiment met 10n kopieën van BamHI-L fragmenten gemengd met 105μg, 102μg, en geen navelstrengbloedcel-DNA.

Alle PBL van proefpersonen met IM en CAEBV waren positief voor het EBV-genoom. Negen (47%) van de 19 monsters van EBV-seropositieve gezonde personen waren positief. Alle PBL van seronegatieve personen waren negatief.

EBV DNA in PBL werd gekwantificeerd en vergeleken voor EBV-seropositieve gezonde controles, kinderen met IM, en kinderen met CAEBV (figuur 1). Bij gezonde EBV- seropositieve kinderen waren de virusbelastingen 100-1000 kopieën per 2,5 × 105 PBL. In PBL van kinderen met IM varieerden de ondergrenzen voor positieve PCR-resultaten van 10° μg (2,5 × 105 PBL) tot 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) genomisch DNA, wat aangeeft dat de virusbelasting 100-100.000 kopieën/2,5 × 105 PBL was. Drie bloedmonsters die binnen een maand na het begin van de ziekte werden afgenomen, vertoonden een hogere belasting (1000-100.000 kopieën/2,5 × 105 PBL). Het PBL dat >11 maand na het begin van IM werd afgenomen, bevatte over het algemeen minder virus. We volgden de virusbelastingen bij 4 IM-patiënten (figuur 2A). Bij alle 4 daalde de virusbelasting tijdens het klinische beloop, maar was hoger (100-10.000 kopieën/2,5 × 105 PBL) dan bij de seropositieve gezonde gastheren.

>